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大豆蛋白改性酶解制备大豆肽的研究
邹险峰
陈
星
李晓磊
李
丹
高长城
（长春大学农产品深加工重点实验室）
【摘要】利用大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽，以单因素试验和正交试验确定
酶解最佳条件，通过高效液相法分析大豆肽的分子量分布，并检测了大豆肽的体外抗氧化效果。结果显示：在20g ／L 的底物浓度下的最佳条件为酶和底物比8000U ／g 、温度55℃、pH 值7．5、水解时间5h ，水解度为51．4％。大豆肽主要为130～1000u 的短肽，占肽总量的86．3％。大豆肽对
－
超氧阴离子（O 2·）和羟自由基（·OH ）的半最大清除浓度分别为1．3mg／mL 和8．0mg／mL 。表
明大豆蛋白改性酶对大豆分离蛋白的水解能力较强，大豆肽有较强的抗氧化功能。
【关键词】大豆分离蛋白；大豆肽；大豆蛋白改性酶；抗氧化中图分类号：TQ 936．2
文献标识码：A
文章编号：1673-7199(2010) 11-0038-05
了大豆蛋白质的利用。近年来，通过酶法水解大豆蛋白得到大豆肽已经得到了科学界的重视。大豆肽分子量小、溶解度高、黏度低、在体内消化吸收快、抗原性低，而且具有抗疲劳、抗氧化、降血压、降低胆固醇、提高免疫力、抗肿瘤以及控制肥胖等多种生理功能，使其应用范围大大扩大，提高了大豆产品的附加值。
大豆分离蛋白是将豆粕去除大豆油和水溶性非蛋
大豆含有丰富的油脂和蛋白质，其中蛋白质占
40％左右。大豆蛋白质含有全部人体的8种必需氨基酸，且比例合理，赖氨酸含量可以与动物蛋白相媲美，而且具有优良的乳化性、发泡性和黏结性，目前成为食品加工业的重要原料。但是，大豆蛋白质的分子量大，低pH 值时溶解度低，高浓度时黏度大，含有腹胀因子、胰蛋白酶抑制剂、血球凝集素等抗营养因子，消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白，因此限制
酸组成的分析［J ］．乳业科学与技术，2009（135）：71～73．［12］Williams JP ，Khan MU ，Wong D．A simple technique for the
The oily press ；1993．
［17］Brockerhoff H．A stereospecific analysis of triglycerides ［J ］．J
analysis of positional distribution of fatty acids on di－and tria-cylglycerols using lipase and phospholipase A2［J ］．J Lipid Res ，1995，36（6）：1407～1412．
［13］赵雷，刘国琴，李琳，等．声波加速脂肪酸价值花的研究［J ］．
中国油脂，2008，33（1）：33～36．
［14］范亚苇，邓泽元，余永红，等．不同脂肪酸甲酯化方法对共轭
亚油酸分析的影响［J ］．中国油脂，2007，32（1）：52～55．［15］Park Y ，Albright KJ ，Cai ZY ，et al．Comparison of methyla-
Lipid Res ，1965（6）：10～15．
［18］林晓珊，黄晓兰，吴惠勤，等．蚕蛹油中脂肪酸组成及其酯型
鉴定［J ］．质谱学报，2009，30（3）：171～174．
基金项目：科技部农业科技成果转化资金项目（2009GB2C600198）；山东省自主创新成果转化重大专项（2009ZHZX1A1303）收稿日期：2010－07－15
作者简介：徐同成（1980—），男，助理研究员，博士，主要从事粮油加工及其营养与安全评价研究。
通讯作者：杜方岭（1972—），男，研究员，所长，主要从事粮油加工研究。通信地址：
（250100）济南市工业北路198号
tion procedures for conjugated linoleic acid and artifact forma-tion by commercial （trimethylsilyl ）diazomethane ［J ］．J Agric Food Chem ，2001，49（3）：1158～1164．
［16］Christie WW．Advances in lipid methodology －two．Dundee ：
38
白组分后得到的一种蛋白质含量不少于90％的混合物，其组成、结构和性质与大豆蛋白相似，基本可以代表纯的大豆蛋白。目前，用于大豆蛋白水解的酶类主要包括：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，或者采用双酶复合水解。大豆蛋白改性酶是目前工业生产大豆蛋白粉的生物复合酶，用于提高大豆蛋白粉的溶解性和分散性，将大豆蛋白改性酶用于生产大豆肽还未见报道。本研究采用大豆蛋白改性酶作为水解酶水解大豆分离蛋白，研究了酶解条件，并对酶解产物大豆肽的清除活性氧自由基的效果进行了分析，为大豆肽的工业生产提供理论依据。
1
材料与方法
1．1
材料与试剂
大豆分离蛋白，吉林省通榆蛋白质厂；大豆蛋白
改性酶，南宁庞博生物工程有限公司；蛋白质分子量标准品（Holo－transferrin，77000u ；Apomyoglobin ，
16951u ；Ribonuclease A ，13700u ；Cytochrome C ，12400u ），肽分子量标准品（Gly－Tyr，239．2u；Val－Tyr－Val ，379．5u；Leu－enkephalin，569．7u；Met－ekephalin，573．7u；Angiotensin Ⅱ，1296u ），美国Sigma 公司；乙腈，美国Tedia 公司，其他化学试剂均为国产分析纯。
1．2仪器与设备
FDU －2100型冷冻干燥仪，日本EYELA 公司；pHS－2型精密酸度计，上海雷磁仪器厂；J－26XP型高速冷冻离心机，美国BECKMAN COULTER 公司；LC－
20A 型高效液相色谱仪、2201型紫外－可见分光光度仪，日本岛津公司。
1．3方法1．3．1
指标测定
蛋白酶活力测定参照SB ／T 10317－1999，蛋白酶活
力测定法。蛋白质含量测定参照GB ／T 5009．5－2003，食品中蛋白质的测定法。水解度（the Degree of Hy-
drolysis ，DH ）的测定采用三氯乙酸（TCA ）法。1．3．2
酶解工艺路线
大豆分离蛋白→调浆→酶解→灭酶→酸沉离心分离→上清液冷冻干燥
准确称量大豆分离蛋白加蒸馏水搅拌均匀，加入一定量的大豆蛋白改性酶，在一定的温度和pH 值条件下水解，到达时间后，90℃灭酶10min ，冷却至室温后加入1mol ／L HCl 调pH 值4．2沉淀未水解蛋白，8000r ／
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min 离心15min ，取上清液冻干。1．3．3
大豆肽的分子量分布
大豆肽的分子量测定参照GB ／T 22492－2008。采用日本岛津高效液相色谱系统，在一定条件下，以蛋白质分子量标准品和肽分子量标准品的色谱图为标准，得到相对分子质量校正曲线及其方程，将大豆肽样品溶液在同等条件下色谱分析后，用GPC 软件进行数据处理，用峰面积归一法计算得到不同肽段相对分子质量分布。
1．3．4大豆肽的抗氧化能力
大豆肽对超氧阴离子（O 2·－
）的清除能力测定采用
邻苯三酚自养化法，大豆肽对羟自由基（·OH ）的清除能力测定采用邻二氮菲－Fe2＋氧化法。
2
结果与分析
2．1
大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的单因素试验2．1．1
底物浓度对水解的影响
水解条件：酶和底物比8000U ／g ，温度50℃，pH
值7．5，水解时间4h 。以水解度为指标研究10、20、
30、40、50g ／L 的底物浓度对水解的影响，结果如图1所示。
大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白在水溶液中进行，大豆分离蛋白不易溶解于水而是分散在水中形成悬浊液，随着蛋白浓度的增加溶液的黏度增加，分散性变差。由图1可知：底物浓度对水解度的影响很大，水解度随着底物浓度的增加而显著下降。实际生产中不仅要考虑水解度，还要考虑生产效率，选择合适的蛋白浓度。
2．1．2酶与底物比对水解的影响
水解条件：底物浓度20g ／L ，温度50℃，pH 值
7．5，水解时间4h 。以水解度为指标研究
4000、6000、
图1
底物浓度对水解度的影响
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8000、10000、12000U ／g 的酶与底物比对水解的影响，结果如图2所示。
图2酶与底物比对水解度的影响
在工业酶解生产大豆肽中，酶浓度是影响成本的重要因素。本试验采用大豆蛋白改性酶固态直接掺入水相反应体系，操作简便。由图2可知：在底物浓度一定时，随着酶浓度的增加，水解度呈上升趋势，但是当酶与底物比达到8000U ／g 时，水解度基本达到峰值，继续增加酶与底物比水解度增加有限。从经济上考虑，酶与底物比对为8000U ／g 较为合适。
2．1．3水解时间对水解的影响
水解条件：底物浓度20g ／L ，酶和底物比8000U ／g ，温度50℃，pH 值7．5。以水解度为指标研究2、3、4、
5、6h 的水解时间对水解的影响，结果如图3所示。
图3水解时间对水解度的影响
由图3可知：随着酶解时间的增加，蛋白水解度逐渐增大，在5h 左右达到最大，继续延长反应时间水解度不再增加。这是因为蛋白酶对热敏感，随时间延长会逐渐失活。因此，本试验条件下，大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的最适反应时间为5h 。
2．1．4pH 值对水解的影响
水解条件：底物浓度20g ／L ，酶和底物比8000U ／g ，温度50℃，水解时间5h 。以水解度为指标研究6．5、
7．0、7．5、8．0、8．5的pH 值对水解的影响，结果如图4
40
图4pH 值对水解度的影响
所示。
由图4可知：在pH 值小于7．5时，水解度随pH 值的升高显著提高；在pH 值大于7．5时，水解度随pH 值增加逐渐降低；在pH 值为7．5时，水解度达到最大。这是因为大豆分离蛋白的等电点为酸性，在中性偏酸性条件下，溶解度会进一步降低，水解度受到酶催化活性和底物溶解性的双重影响而变化较大；在偏碱性条件下，水解度只受到酶催化活性的影响。因此，本试验条件下，大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的最适pH 值为7．5。
2．1．5水解温度对水解的影响
水解条件：底物浓度20g ／L ，酶和底物比8000U ／
g ，pH 值7．5，水解时间5h 。以水解度为指标研究40、45、50、55、60℃的水解温度对水解的影响，结果如图5所示。
图5
水解温度对水解度的影响
由图5可知：低温对水解度的影响较大，随着水解温度的增加，蛋白水解度逐渐增大，在55℃左右达到最大，继续升高温度会导致水解度的下降。这是因为温度对酶解反应造成双重影响，
一方面温度增加会
降低溶液的黏度，提高蛋白质的分散性，有利于酶与底物的结合，提高水解度；另一方面，酶有最适反应温度，过高的温度会加速酶的变性导致水解度降低。因此，本试验条件下，大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的最适温度为55℃。
2．2酶解反应的正交试验
由于底物浓度对水解度的影响很大，考虑到工业
生产效率，并且避免底物浓度掩盖正交设计中其他因素的作用效果，我们选取了20g ／L 的底物浓度作为试验浓度。根据单因素试验的结果，对酶和底物比、水解时间、温度和pH 值4种因素各取3个水平，进行L 9（34）正交试验，试验结果见表1。
表1
正交试验结果
试验号
酶与底物比
水解时间
温度
pH 值
水解度A （U ／g ）B （h ）C （℃）D （％）
11（4000）
1（4）1（50）1（7．0）32．8212（5）2（55）2（7．5）40．6313（6）3（60）3（8．0）38．442（6000）
12342．95223140．96231245．173（8000）
13245．48321343．39
332141．3
K 137．26740．36740．40038．333K 242．96741．60041．60043．700K 343．33341．60041．56741．533R
6．066
1．233
1．200
5．367
由极差分析可知：各因素对水解度的影响大小顺序为A ＞D ＞B ＞C ，即酶和底物比＞pH 值＞水解时间
＞温度。根据K 值大小得到酶解反应条件的优组合为
A 3B 2C 2D 2，即酶和底物比8000U ／g ，温度55℃，pH 值
7．5，水解时间5h 。优组合条件下的水解度为51．4％。
图6大豆肽的高效分子排阻色谱分析
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2．3大豆肽的分子量分布
对大豆肽进行高效分子排阻色谱分析，洗脱图谱
如图6所示，通过GPC 软件计算后分子量分布情况见表2。
表2
大豆肽的分子量分布
分子量范围（u ）
含量（％）
数均分子质量（u ）重均分子质量（u ）
＞[1**********]0～100000．[**************]0～50009．[**************]～100034．[1**********]00～50030．[1**********]30～30021．3684213224
＜130
3．8935
－
－
由表2可知：大豆肽主要集中在130～1000u 之间，
占肽总量的86．3％。其中300～1000u 为2～8个氨基酸残基的短肽，这部分占肽总量的64．9％；130～300u占
21．4％，根据数均分子量和重均分子量分析，其主要成分为二肽，还有少量的氨基酸。此外还有9．4％的分子量为1000～5000u 的多肽，根据数均分子量和重均分子量分析，其肽链长度主要为15个氨基酸残基左右。说明了大豆蛋白改性酶对大豆分离蛋白的水解充分，水解产物均一性很好，而且并未产生大量的氨基酸，有利于产物的进一步分离纯化和性质鉴定。
2．4大豆肽的体外抗氧化能力
试验了不同浓度的大豆肽对O 2·－
和·OH 的清除效
图7
大豆肽对O 2·－
的清除效果
图8大豆肽对·OH 的清除效果
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果，结果如图7和图8所示。
由图7和图8可知：大豆肽对O 2·－
和·OH 均有清
除作用，半最大清除浓度（Half－maximalScavenging
Concentration ，SC50）分别为1．3mg／mL 和8．0mg／mL ，说明了大豆蛋白改性酶对大豆分离蛋白的水解产物具
有较高的清除O 2·－和·OH 能力，且清除O 2
·－
的能力更强。王莉娟等人采用碱性蛋白酶水解脱脂豆粕粉得到
大豆肽，该大豆肽同样具有清除O ·2－
和·OH 能力，其
SC50分别为25．4mg／mL 和8．1mg／mL ，本研究获得的大
豆肽与其比较，清除·OH 能力相近，但清除O 2
·－
的活性高出了一个数量级，一方面是由于大豆蛋白改性酶与碱性蛋白酶水解作用位点不同，得到的肽段也就不同，另一方面本研究获得的大豆肽的分子量主要集中在130～1000u 之间，占肽总量的86．3％，均一性极高，
该大小的肽段可能更有利于清除O 2·－
。
自由基是由单质或化合物的均裂而产生的带有未成对电子的原子或基团。它的单电子有强烈的配对倾向，与其他原子基团结合，形成更稳定的结构，因而非常活跃，成为许多反应的活性中间体。人体内的自由基分为氧自由基和非氧自由基，其中氧自由基占自
由基总量的95％。氧自由基中以超氧阴离子（O 2
·－
）、羟自由基（·OH ）和过氧化氢（H 2O 2）最为常见。人体细胞在正常的代谢过程或受到外界条件的刺激（如高压氧、高能辐射、抗癌剂、抗菌剂等），都会产生活性氧自由基。自由基作为人体的正常代谢产物，在一定量范围内对机体的正常代谢有促进作用，可以增强白细胞的吞噬作用，促进前列腺素的合成，参与蛋白质和酶的合成。然而，受到外界刺激产生的过量的氧自由基对人体损害极大，能够破坏机体内的大分子，如核酸、蛋白质、糖和脂质等，从而破坏细胞的结构和功能，导致组织破坏和退行性变化。O 2·是机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤主要表现在使核酸链断裂、多糖解聚及不饱和脂肪酸过氧化作用进而造成膜损伤、线粒体氧化磷酸化及其他变化。·OH 是最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基。它可以和活细胞中的任何分子反应而造成损伤，而且反应速度极快，破坏糖类、氨基酸、磷脂、核苷和有机酸等分子。
本研究获得的大豆肽对O 2·－
和·OH 都表现出较好的清
除作用，可以保护机体免受氧化损伤，减少炎症、高血压、心脑血管疾病、癌症等多种疾病的发生，延缓衰老，提高人类的生活质量。因此，大豆肽的生产和
42
应用具有重要的价值。
3结论
采用大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白得到大豆
肽，结果表明：在20g ／L 的浓度下最佳的酶解条件为酶和底物比8000U ／g 、温度55℃、pH 值7．5、水解时间5h ，水解度为51．4％。。高效分子排阻色谱分析表明，大豆肽主要为130～1000u 的短肽，占肽总量的
86．3％。体外抗氧化能力分析表明，大豆肽对O 2
·－
和·OH 均有清除作用，SC50分别为1．3mg／mL 和8．0mg／
mL ，清除O ·2
－
的能力更强。大豆蛋白改性酶作为水解酶应可作用于各种蛋白质，对其他蛋白质的水解效果有待深入研究，其为蛋白水解肽的制备提供了新的酶类。本研究为工业生产大豆肽提供了理论依据。
参考文献
［1］丛建民．二次回归通用旋转组合设计酶解法制备大豆肽的研究
［J ］．食品科学，2008，29（5）：319～323．
［2］李和平，蔡风英，刘来亭，等．中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的
工业优化［J ］．粮油食品科技，2009，17（5）：14～16．［3］左继红，崔政伟，邬敏辰，等．木瓜蛋白酶水解大豆蛋白工业条
件的优化［J ］．农产品加工，2008（4）67～73．
［4］刘志伟，刘秀梅，郑梦云，等．大豆蛋白体外酶解物中血管紧张
素转化酶抑制剂活性肽研究［J ］．营养学报，2007，29（1）：
69～73．
［5］宋春丽，迟玉杰．两种双酶切大豆分离蛋白技术路线的比较
［J ］．食品科学，2008，29（5）：65～68．
［6］肖凯军，高孔荣，曾庆孝．酶解大豆分离蛋白的特性研究［J ］．
广州食品工业科技，1995，1（2）：5～10．
［7］徐力，赵忠岩，李鸿梅，等．大豆蛋白的小分子酶解产物抗氧化
活性研究［J ］．吉林农业大学学报，2007，29（1）：48～52．［8］金鸣，蔡亚欣，李金荣，等．邻二氮菲－Fe2＋氧化法检测H 2O 2／
Fe 2＋产生的羟自由基［J ］．生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553～555．
［9］王莉娟，陶文沂．大豆肽体外抗氧化活性研究［J ］．生物加工过
程，2008，6（4）：69～73．
基金项目：吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目（2008365）；
吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目（2009229）；长春市科
技计划项目（08YJ18）收稿日期：2010－07－14
作者简介：邹险峰（1971—），男，吉林长春人，博士，讲师，研究方向为食品生物技术。
通讯作者：高长城（1962—），男，吉林辽源人，主任，教授，研究方向为农产品深加工。通信地址：
（130022）长春市卫星路6543号