激肽释放酶原激活剂测定法

附录Ⅸ F 激肽释放酶原激活剂测定法

本法系采用显色底物法（或显色基质法）测定供试品中激肽释放酶原激活剂(PKA)含量。 试剂（1）0. 05mol/L三羟甲基氨基甲烷 0. 15mol/L氯化钠溶液（TNB ）用1mol/L盐酸调节pH 值至8. 0。

（2）2mmol/L激肽释放酶显色底物(S-2302) 溶液 称取S -2302 12. 5mg ，加10ml 水溶解。

（3）前激肽释放酶（PK ） 采用适宜方法提纯PK ，小体积分装，-30℃以下保存备用。 PKA 标准溶液的制备取PKA 标准品适量，用0. 85%氯化钠溶液稀释成每1ml 中含10. 0IU 、20. 0IU 、30. 0IU 、40. 0IU 、50. 0 IU 的溶液。按每次用量，小体积分装，-30℃保存备用，用前融化(仅允许冻融1次) ，并用TNB 稀释10倍。

供试品溶液的制备 取供试品适量，用TNB 稀释10倍。

测定法

取供试品溶液20μl 加至96孔微量滴定板孔内，加PK 20μl -50μl ，振荡1分钟，加盖置25～30℃放置30分钟（或37℃ 10分钟）后，加2mmol/L S-2302溶液20μl ，振荡1分钟，加盖置25～30℃放置15分钟（或37℃ 10分钟），加50%醋酸溶液20μl ，振荡1分钟后，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A ），在波长405nm 处测定吸光度。同时以TNB 20μl ~50μl 代替PK 20μl ~50μl ，同法操作，作为空白对照。用PKA 标准溶液20μl 替代供试品溶液，同法操作。将标准品溶液PKA 活性的对数对其相应的吸光度对数进行线性回归，求出回归方程，计算出供试品PKA 活性。

【附注】（1）每个标准溶液和供试品做3孔，其中2个测定孔、1个对照孔，两个测定孔吸光度差值应小于0. 020。

（2）每次测定可根据供试品PKA 含量，适当调整PKA 标准溶液的范围。

（3）线性回归的相关系数应不低于0. 99。

（4）加PK 、S -2302及50%醋酸溶液时，各孔的间隔时间应相同，加液的顺序要一致，尽可能使各孔处于同一反应条件下。