抗黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的制备

抗黄曲霉毒素M 1免疫亲和柱的制备

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江省 大庆市 163319）

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江省 齐齐哈尔市 161006）

（北京华安麦科生物技术有限公司，北京市 102200）

摘要：【目的】 制备黄曲霉毒素M 1污染样品的净化前处理免疫亲和柱。【方法】利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M 1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B进行偶联、装柱后通过IC-ELSIA 对免疫亲和柱的性能评价确立了最佳反应条件。【结果】 免疫亲和柱的有效柱容量为500ng, 经添加回收试验测定的平均回收率为92.46%,变异系数2.3%～

7.2%。【结论】利用高纯度抗黄曲霉毒素M 1单克隆抗体和溴化氰活化的Sepharose 4B制备的免疫亲和柱可应用于乳制品等食品中黄曲霉毒素M 1污染度测定的样品快速前处理。

关键词：黄曲霉毒素M 1；免疫亲和柱；无血清培养基

Preparation of Immunoaffinity Column for Anti-AFM1

Sun Xing-Rong1，Pei Shi-Chun2，Liu Jia-Peng3，Wang Ying4

(1 Food Science College, HLJ August First Land Reclamation University, Daqing 163319, China) (2 Food and Biological Engineering College, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China)

(34Beijing Huaan Magnech Bio-Tech Co., Ltd.,Beijing 102200, China) ，

Abstract:[objective] preparation of aflatoxin M 1 immunoaffinity column for clean-up contaminated samples. [Method] prepared high-purity anti-aflatoxin M 1 monoclonal antibody with serum-free medium and coupled with CNBr Activated Sepharose 4B, the column has been evaluated through IC-ELISA and established the optimum reaction conditions. [Results] the capacity of immunoaffinity column was 500 ng , the average recovery of aflatoxin M 1 was 92.46 %,the variation coefficients were 2.3% ~ 7.2%.

[Conclusions] the immunoaffinity columns was prepared by coupling high-purity anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with CNBr Activated Sepharose 4B can be applied to detect contamination samples fast, such as aflatoxin M1 in dairy products.

Keywords: aflatoxin M1, immunoaffinity column, serum-free medium

黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF ）是食品中广泛存在的一种高致癌性真菌毒素，是Asperillus flavus 和Asperillus parasiticus 的二次代谢产物, 黄曲霉毒素M 1（Aflatoxin M1, AFM1）

是动物摄入黄曲霉毒素B 1(Aflatoxin B1, AFB1) 后在体内经羟基化而形成的产物，主要存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类等，其中以乳最为常见[1-3]。

黄曲霉毒素M 1的检测国家新标准GB 5413.37-2010[4]中对乳和乳制品中黄曲霉毒素M 1的检测方法有“免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法”、 “免疫亲和层析净化高效液相色谱”、 “免疫亲和层析净化荧光分光法”、“双流向酶联免疫法”等4种，其中多数测定方法均要使用以抗黄曲霉毒素M 1抗体为基础的免疫亲和层析技术。

本研究利用无血清培养基制备的高纯度抗黄曲霉毒素M 1单克隆抗体为基础，制备了免疫亲和柱，并对其性能进行了分析。

1 材料和方法

1.1试验材料

1.1.1 实验试剂

抗黄曲霉毒素M 1（AFM 1）单克隆抗体由本实验室自制；AFM 1人工抗原购自Sigma 公司； Aflatoxin M1购自FERMENTEK 公司；OPD 、羊抗鼠IgG-HRP 酶标二抗购自Sigma 公司；CNBr 活化的SepHarose 4B 购自PHarmacia 公司；亲和柱柱管购自深圳逗点公司；96孔酶标板购自Costar 公司；Protein A （SPA ）亲和柱等购自Sigma 公司；MD6无血清哺乳细胞培养基购自上海麦伯星生物科技有限公司，DMEM 培养基购自Invitrogen 公司；优级胎牛血清（FBS ）购自中国医学院生物医学工程研究所灏洋生物制品科技有限责任公司；其他分析和有机试剂均为优级以上。

1.1.2 试验仪器与设备：

酶标仪为瑞典TECAN 公司产品；JK04S 凝胶成像系统为北京君意东方电泳设备有限公司产品；低温高速离心机为Thermo 公司。96孔洗板机（美国 Skan Wahser400），96孔加样机（Costar Transtar-96），全自动加样机（Genetix QFill3），微孔板分液器（Biotex ，Ufill ），HL-恒流泵（上海），Stirred ultrafiltration cells(美国 Millipore) ，超净工作台（美国Purifier Logic A2），微量紫外分光光度计（GE Nano-Drop），精密分析天平（瑞士Metter ），细胞离心机（德国Eppendorf ），灭菌器（TMQ.C5090, 山东新华）等。

1.2 实验方法

1.2.1抗AFM1单克隆抗体的纯化

将分泌抗黄曲霉毒素M 1单克隆抗体的杂交瘤细胞用200mL 的MD6无血清培养基扩大培养至96%以上的细胞死亡后，取培养基利用protein A亲和层析，利用Stirred ultrafiltration cells 进行浓缩后分装待用[5]。

1.2.2 AFM1单克隆抗体的免疫亲和柱的制备

参照CNBr 活化的Sepharose 4B胶产品说明书略作修改，具体操作步骤如下：

1.2.2.1 洗涤

将CNBr 活化的Sepharose 4B 干胶悬浮于1 mmol •L -1 HCl 中溶涨，砂芯漏斗中快速抽洗15min 。

1.2.2.2 偶联

将预处理的胶迅速转移至含有AFM 1单抗的偶联缓冲液中（0.1 mo l ·L -1 NaHCO 3,0.5 mol ·L -1 NaCl,pH8.3），室温1h 或4℃过夜温和搅拌，使AFM1单克隆抗体与CNBr 活化的Sepharose 4B充分偶联。用大于5倍凝胶体积的偶联缓冲液洗去未偶联的抗AFM 1抗体，收集全部洗脱液，紫外分光光度计测定洗脱液中未偶联蛋白含量，计算偶联率[6-7]。

1.2.3.3 封闭

0.1mol ·L -1 pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液室温封闭2h 。

1.2.3.4 洗涤

用约5倍体积的0.1 mol.L-1醋酸缓冲液（pH4.0, 含0·5 mol.L-1 NaCl ）和0.1 mol·L -1 Tris-HCl （pH 8.0,含0.5 mol·L -1 NaCl）先后交替洗涤4～6次。

1.2.3.5 装柱

取1ml 柱管，垫好筛板，将PBS 缓冲液（0.01 mol·L -1 pH 7.4）悬浮的偶联胶装柱，至胶高度为0.5ml ，PBS 平衡， 封住口底，冰箱4℃保存。

1.2.3 上样缓冲液PH 值的选择

平衡缓冲液冲洗涤柱胶，分别以1mL （AFM 1的含量为200ng ） pH 7.0、pH 7.2、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8的上样缓冲液以3ml ·min -1的流速流过免疫亲和柱，收集通过柱体的上样缓冲液，用IC-ELISA 方法测定收集液中的AFM 1含量，进而确定最优pH 值.

1.2.4上样缓冲液流速的选择

AFM 1的上样量为200ng ，分别以0.5 mL·min -1、1 mL·min -1、2 mL·min -1、3 mL·min -1、4 mL ·min -1、5 mL ·min -1、6 mL ·min -1的流速通过柱体，经洗涤收集洗脱液，IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM 1含量，进而确定上样缓冲液的最佳流速。

1.2.5 洗脱条件的选择

AFM 1的上样量为200ng ，分别用3 mL 60%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、80%甲醇-水

溶液、90%甲醇-水溶液、纯甲醇-水溶液进行洗脱，收集洗脱液，用IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM 1含量，进而确定最优洗脱条件。

1.2.6 样品加标回收率的测定

分别将100 ng.ml -1～500 ng.ml -1的AFM 1标准品加入到预处理的的鲜奶样品中，将溶液以3 mL·min -1的流速通过免疫亲和柱，超纯水洗涤后，3mL 90%的甲醇-水溶液进行洗脱，IC-ELISA 方法测定收集洗脱液中的AFM 1含量，每个浓度作3次平均实验，计算加标回收率。

2结果与分析

2.1抗AFM 1单抗纯化效果的评价

目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法；另一是体外培养法。动物体内生产即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白，不易于进一步纯化。体外培养法即利用无血清培养基培养杂交瘤细胞来来制备单抗，没有其它免疫球蛋白的污染，大大简化了抗体的提纯，有助于大规模生产。无血清培养基和小鼠腹水制备的抗AFM 1单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE 结果如图1所示。由图1可以看出，经无血清培养基制备的单抗后经亲和纯化所得到的抗体纯度良好，有效去除了其中的杂蛋白，两条目的条带清晰可见，无其他杂抗体出现，其中一条为重链（约50kD ）另一条为轻链(约25KD) ，纯化效果良好。

1 2 3

图1 无血清培养基和小鼠腹水制备的抗AFM 1单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE

1. 无血清培养基制备的AFM 1单抗 2. 小鼠腹水制备的单抗 3.Marker

Fig.1 SDS-PAGE patterns of preparation of anti-aflatoxin M1 monoclonal antibody with

serum-free medium and mouse ascites

1. Serum-free anti-AFM1 McAb 2. Mouse ascites anti- AFM1 McAb 3. Marker

2.2 AFM1单克隆抗体免疫亲和柱的柱容量及偶联率的测定

2.2.1 柱容量的测定

首先加入800ng 的AFM 1标准品，通过免疫亲和柱，经洗脱，利用IC-ELISA 测定洗脱液中的AFM 1量为300ng, 由此可知免疫亲和柱可吸附500ng 的AFM 1，即该柱的柱容量为500ng 。

2.2.2偶联率的测定

抗体浓度=（A 0-A 1）/1.35×稀释倍数[6]

偶联率(%)=(偶联前抗体总量－未偶联抗体总量)/偶联前抗体总量×100%[7]

A 0——抗体蛋白在280nm 处的吸光度值

A 1——空白对照的吸光度值；

1.35——蛋白系数

利用上述测定方法，由偶联率计算公式得偶联率为94%。

2.3上样缓冲液PH 值的选择

IC-ELISA 对pH7.0、pH7.2、pH7.4、pH7.6、pH7.8的上样缓冲液（AFM 1的含量为200ng ）的上样效果进行分析，计算吸附率，如图4所示，上样缓冲液pH7.2时可使AFM 1的吸附率达到最大，因此，选择上样缓冲液pH7.2作为最佳pH 值。

图4. 上样缓冲液pH 值对吸附率的影响

Fig.4 The effects of pH on absorbtion rate

2.4上样缓冲液流速的选择

IC-ELISA 对上样流速分别为0.5 mL·min -1、1 mL·min -1、2 mL·min -1、3 mL·min -1、4 mL·min -1、5 mL·min -1、6 mL·min -1的上样效果进行分析，计算吸附率，如图5所示，上样缓冲液以3 mL·min -1的流速通过亲和柱时可使AFM 1的吸附率达到最大，因此，选择

3 mL·min -1作为上样缓冲液最佳流速。

图5. 上样缓冲液流速与吸附率的关系

Fig.5 The effects of flow speed on absorbtion rate

2.5 洗脱条件的选择

IC-ELISA 对60%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、80%甲醇-水溶液、90%甲醇-水溶液、纯甲醇-水溶液的洗脱效果进行分析，计算洗脱率，如图6所示，90%甲醇-水溶液可使AFM 1全部洗脱，因此，选择90%甲醇-水溶液作为洗脱液。

图6. 甲醇浓度对洗脱率的影响

Fig.6 The effects of methanol concentration on elution rate

2.6 样品加标回收率的测定

分别将100ng ·mL -1～500ng ·mL -1的AFM 1标准品加入到预处理的的鲜奶样品中，将溶液以3 mL·min -1的流速通过免疫亲和柱，进行样品加标回收率实验。

表1 AFM 1单克隆抗体免疫亲和柱样品加标回收率

Table 1 The recovery of AFM1 monoclonal antibody affinity chromatography column AFM 1添加量(ng) 100 200 300 400 500

平均回收量（ng ）

回收率（%）

变异系数（%）

3. 结 论 86.5 86.5 7.2 189.4 94.7 5.1 271.3 90.4 4.4 374.4 93.6 2.3 485.2 97.1 2.8

本实验研制的AFM 1单克隆抗体免疫亲和柱，柱容量为500ng ，确定了AFM 1单克隆抗体免疫亲和柱的上样条件：PH 7.2，流速3 mL.min-1，洗脱条件：90%的甲醇-水溶液。经加标回收率实验测定，回收率范围为86.6%～97.1%。

本研究制备的免疫亲和柱为利用无血清培养基制备的高纯度抗AFM 1单克隆抗体进行制备，从本实验结果来看，本实验所用单克隆抗体具有很强的黄曲霉毒素M 1结合力，亲和柱对样品的纯化效果显著，操作简便易行。目前我国对免疫亲和柱的需求大部分还依赖于进口，且价格昂贵，使免疫亲和柱的应用受到限制，本实验制备的免疫亲和柱为今后进一步开发此类免疫亲和柱提供了可靠的数据基础。

参考文献

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[2] Rastogi,S.,Dwivedi,P .D.,Khanna,S.K., ＆Das,M.Detection of aflatoxin M 1 contamination in milk and infant milk products from Indian markets by ELISA[J].Food Control,2004,15:287-290.

[3] Codex Alimentarius Commission.Comments submitted on the draft maximum level for aflatoxin M1 in milk[C].Codex committee on food additives and contamination 33rd session,hague The Nehtherlands,2001.

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[5] 裴世春，何娜，张立军，等. 应用HTS-ELISA 筛选方法制备抗黄曲霉毒素M 1单抗[J].微生物学报，2010,50（10）：1406-1411

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