高滴度慢病毒的制备和纯化

高滴度慢病毒的制备和纯化Production, Purification of Lentivirus for

High-titer

吴渊 潘建青 罗振 王立平

摘 要 基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体是一种广泛用于体外和动物实验的转基因载体。慢病毒载体可以感染分化和非分化细胞，被感染的细胞长期稳定的表达转基因产物。最近，慢病毒载体已经被广泛地应用于中枢神经系统的转基因研究。本文将介绍一种新的慢病毒制备方法。本方法制备和纯化的慢病毒可直接用于在活体中标记细胞特异性的神经元。

关键词 慢病毒；光感基因调控技术

ABSTRACT 　Lentivirus vector based on the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) is primarily a research tool to introduce a gene product into in vitro systems or animal models. The advantage of lentivirus vector is the ability for gene transfer and integration into dividing and non-dividing cells. Recently, the lentivirus system is used to transduce heterologous gene efficiently into central neural system. In this paper, we propose a novel protocol for lentivirus production. The highly purified and concentrated viruses can be used in cell-specific and in vivo neural labeling.KEYWORDS Lentivirus; Optogenetics

1 引言

慢病毒(lentivirus)为一类逆转录病毒的总称, 是基于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改建而来的载体系统，以其高效而稳定的特点被作为基因治疗动物实验的常用选择。相比传统的逆转录病毒载体,新一代的慢病毒载体主要有以下几个优点: a)慢病毒载体既可以转染分裂中细胞，包括造血干细胞,神经干细胞等,又可以感染分化终末的细胞，包括神经元,肝实质细胞等；b)由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力,在体外培养细胞实验和动物实验中,由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表达；c)慢病毒载体可以兼容多个转录启动子,包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子；d)经过改建后的慢病毒载体可以容纳约10kb左右的外源基因,因此绝大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体。慢病毒载体的上述优点使其成为体内和体外基因转移的一种有效工具。

2006年诞生了一个新词汇-----光感基因调控技术(Optogenetics)，Oxford 大学的Miesenbock把光感基因调控技术定义为：生物技术一项分支，融合了基因工程技术和光学技术，通常在活体动物水平，通过光来观察或控制某一特定细胞亚群的活动和功能。

斯坦福大学生物工程学系Deisseroth 实验室，利用慢病毒载体将ChR2导入体外培养的神经元细胞，第一次在细胞水平上用光快速、精确控制神经元的兴奋性，并证实在活体脑片上可用光刺激ChR2来研究神经细胞之间的相互联系。Abbott等将ChR2导入大鼠延髓腹外侧核，然后用蓝光刺激该核团，则交感神经活性增加，血压升高。这些研究通过慢病毒载体将光感基因导入实验动物的大脑，持久稳定的表达ChR2或NphR蛋白，在蓝/黄光的刺激下，兴奋或抑制特定的神经元。通过这种光调控方式，我们能够解析神经精神系统疾病病理状态下神经回路的特征，进而为修复病理条件下的神经回路提供理论依据。

图1 慢病毒载体系统构成

（a）转移质粒（b）辅助质粒（c）包膜糖蛋白表达质粒

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我们课题组建立了一种慢病毒的制备和纯化方法，该方法可获得的含有109vp/ml病毒颗粒的悬浮液。利用立体定向技术将携带有光感基因的病毒注射到C57L/J小鼠的海马部位。注射病毒后第10 天，在正置荧光显微镜下观察脑片，可见海马区的病毒注射部位有荧光蛋白表达。证实了该方法制备的慢病毒可在实验动物神经系统的特定部位表达光感基因。

轻吹打混匀，在室温下静置5分钟。同时在另一个5ml 离心管中加入1.5ml的DMEM培养基，然后配制DNA混合物： 22 μg 慢病毒基因载体质粒、15 μg pDelta 8.74 辅助质粒、7 μg pMD2.G 质粒(VSVg, 外壳蛋白)，轻轻吹打混匀。然后将DNA混合物加至孵育了的Fugene HD中，并轻轻吹打混匀，室温静置40分钟。

每个T175培养瓶加入3.5 ml的转染混合物，前后摇晃4-6次后放入培养箱中。

4.3更换培养基(第2日)：

2 材料及方法：

1. 试剂和细胞株

Ultraculture medium 购自Lonza公司；FBS购自GIBCO公司；DMEM购自Invitrogen公司；丁酸钠购自SIGMA公司；Fugene HD购自 Roche公司； HEK293FT 细胞株购自Invitrogen公司；D10培养基(500 ml DMEM，50 ml FBS，5 ml 青霉素/链霉素溶液，5 ml 丙酮酸钠溶液，0.22μm滤过除菌)； Production培养基 (500ml Ultraculture medium，5 ml 青霉素链霉素 ，5 ml 丙酮酸钠，5 ml 0.5M 丁酸钠溶液, 0.22μm滤过除菌)。2. 仪器

制备型超速离心机(BECKMAN OPTIMAL-80XP)；高效离心机(BECKMAN AVANTIJ-26XP)；二氧化碳培养箱(三洋MCO-175)；生物安全柜(NUAIRE NU-430-400E)。超速离心管 (Beckman 344058) 。3. 细胞培养

贴壁生长的HEK 293FT细胞，待其汇合度达到60%时，除去培养基，加入10ml PBS洗涤，然后加入2ml的0.25%的胰酶消化，待细胞开始变圆时去除胰酶，立即加入10ml DMEM完全培养基，反复吹打成单个细胞，按105/ml接种 5%CO2 37℃培养。 4. 转染

4.1 细胞准备(第0日)：将3个汇合度达到90%的15cm培养皿，消化后接种于4个T175培养瓶中，每瓶加入25ml D10培养基。

4.2 转染细胞(第1日)：

转染24小时后，移去D10培养基，在瓶中加入20ml Production培养基。此步骤可能使细胞脱落，操作时应轻柔。5. 收获病毒(第3-4日)：

转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20ml Production培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4℃离心，1000rpm 5分钟，去除细胞碎片，然后0.45 μm滤膜过滤。 取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干。每管加入30ml 病毒上清，然后将2ml的20%蔗糖溶液(PBS配制)轻轻加入上清液的底部，形成一个蔗糖垫。务必确定离心管没有裂缝且两两平衡。4℃离心，25000rpm 2 h。离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。 将超速离心管倒置在吸水纸上晾干，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。100ul冷PBS重悬，并轻轻吹打溶解沉淀，注意避免产生气泡。分装5ul/管，-80℃冻存。

3 结论

按照本试验指南的方法通常能够产生109-1010PFU/ul病毒滴度，若病毒滴度108PFU/ul以下表明操作中存在某些问题或是试剂质量达不到标准。严格按照我们的实验步骤进行能够得到更高浓度的病毒颗粒。在实验中应注意，避免基因毒性产物、多聚腺苷酸化、转染细胞异常等问题的出现。

观察细胞，在汇合度接近100%时换液，加入16ml D10培养基。

在5ml 离心管中加入2ml DMEM 培养基，然后加入100 μl Fugene HD，注意不要碰到管壁，轻

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作者简介

吴 渊 男，贵阳医学院硕士研究生，中科院深圳先

进技术研究院客座学生，研究方向：分子肿瘤学。潘建青 作者简介见本期第48页。 王立平 作者简介见本期封2页。

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