生物工艺学知识点总结

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生物工艺学期末复

生物工艺学知识点总结

第一章 绪论

1、生物工艺学（biotechnology）：

又称为生物技术，它是应用自然科学及工程学原理，依靠生物作用剂(biological agents)的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。 特点：多学科和多技术的结合；生物作用剂（生物催化剂）的参与；应用大量高、精、尖设备；建立工业生产过程或进行社会服务，。

生物工艺学包含的四大块内容：原料预处理和培养基的制备、菌种的选育及代谢调节、生物反应过程的工艺控制、下游加工。

2、生物催化剂是游离的或固定化的细胞或酶的总称。

生物催化剂特点：

优点：①常温、常压下反应 ②反应速率大 ③催化作用专一 ④价格低廉 缺点：稳定性差 控制条件严格 易变异（细胞）

生物反应过程实质是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程(process engineering)。

3、生物技术研究的主要内容：

基因工程(DNA重组技术，gene engineering) 、细胞工程(cell engineering)、酶工程(enzyme engineering)、发酵工程(fermentation engineering)、蛋白质工程(protein engineering)、

第二章 菌种的来源

1、工业生产常用的微生物

细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类。

2. 工业生产对微生物菌种的要求

培养基成分简单、廉价、来源广。

生长迅速、发酵周期较短，抗杂菌和噬菌体能力强。

目的产物产量高，产物类似物的产量低，且目的产物最好能分泌到胞外，利于产物分离。

对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感。

对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。

菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

3、分离微生物新种的过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。

含微生物材料的预处理方法：物理方法（加热）；化学方法（pH）；诱饵法。 诱饵技术：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。 分离的效率影响因素 ： 1）培养基的养分； 2）pH； 3）加入的选择性抑制剂。

4、高产培养基成分的选择准则：

制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、N、P、O）； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分；

避免使用容易同化的碳（葡萄糖）或氮（NH4+），它们可能引起分解代谢物阻遏； 确定含有所需的辅因子(Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+)

加入缓冲溶液以减小pH变化。

5、代谢控制发酵（Metabolic Control fermentation）：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。

6、菌种的衰退表观现象有哪些？

目的产物的产量下降

营养物质代谢和生长繁殖能力下降

发酵周期延长

抗不良环境的性能减弱

7、菌种的衰退的原因

菌种保藏不当

提供不了当的条件或不利的条件

经诱变得到的新菌株发生回复突变

8、菌种的复壮方法：

纯种分离

通过寄主体进行复壮

淘汰已衰退的个体

9、菌种的保藏的原理

根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

10、菌种的保藏方法：

A 斜面冰箱保藏法

B 沙土管保藏法

C 石蜡油封存法

D 真空冷冻干燥保藏法

E 液氮超低温保藏法

11与生物工程相关性较大的国内主要菌种保藏机构包括：

工业微生物菌种保臧管理中心、农业微生物菌种保藏管理中心、普通微生物菌种保臧管理中心、抗生素菌种保藏管理中心

11 从自然环境中分离微生物菌种的的工艺过程

12. 生物工程专业相关的主要数据库有哪些？

维普中文科技期刊数据库、中国期刊全文数据库、万方系列数据库、science online、springer link等。

第三章 菌种选育

1、 常用菌种选育方法

（1）自然选育:是指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变(spontaneous mutation)而进行菌种筛选的过程。

特点：自发突变的频率较低，变异程度不大。所以该法培育新菌种的过程十分缓慢。

应用：自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。

（2）诱变育种:是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究使用。诱变育种的理论基础是基因突变。

诱变育种的典型流程

常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物、与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质）、生物诱变剂

（3）分子育种（DNA重组、基因工程）：用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

（4）杂交育种(Hybridization)：

常规杂交育种(Hybridization)：一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。

原生质体融合技术：通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦称为“细胞融合”(cell fusion)。

原生质体融合的基本过程：原生质体形成、原生质体融合、原生质体的再生。

3.抗噬菌体菌株的检出方法：

平板点滴法、单层琼脂法、双层琼脂法。

4、 工程菌的不稳定性表现

质粒的不稳定（质粒的丢失、重组质粒的DNA片段脱落）、表达产物的不稳定

第三章 微生物的代谢调节

1、微生物代谢调节方式

概念：微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是相互协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反应,其原则是经济合理地利用和合成所需的各种物质和能量,使细胞处于平衡生长状态。微生物代谢分为初级代谢和次级代谢。

代谢流向的调控分为代谢物的合成和代谢物的降解；通过快速启动蛋白质的合成和有关的代谢途径，平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化。 代谢速度的调控分为酶量（粗调）（酶合成的诱导和酶合成的阻遏）和酶活（细调）（酶活性的激活、酶活性的抑制）

反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢；影响催化一系列反应的多个酶

反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。只对是一系列反应中的第一个酶起作用

2、微生物初级代谢调节包括酶活调节、酶合成调节、遗传控制

（1）酶活性的调节（细调）：一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。酶活调节的影响因素包括：底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等。特点是反应快速。

酶活性的调节包括：酶活性的激活和酶活性的抑制（反馈抑制）

（2）酶合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、缓慢的

（3）酶合成的阻遏：在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。

末端代谢产物阻遏:由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏。

分解代谢物阻遏：当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。 这种阻遏并不是由于快速利用

底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏（过去被称为葡萄糖效应）。

3、改变细胞膜通透性的方法

A限制培养基中生物素浓度在1～5mg/L，控制细胞膜中脂质的合成；

B 加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联；

C 加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂(如聚氧化乙酰硬脂酰胺)，将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加；

D 控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成；

E 可以通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株。

5、人工控制微生物代谢的两种手段：

（1）生物合成途径的遗传控制

（2）发酵条件的控制

6. 生物素对谷氨酸合成的影响

（1）生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而有利于谷氨酸的合成；

（2）生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。

生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而有利于谷氨酸的合成；

生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。例1：谷氨酸棒杆菌（生物素缺陷型）生产谷氨酸

PEP Pyr

PCAcCoAOAA akg

MalGlu

生物素对谷氨酸合成的影响

PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr：丙酮酸；AcCoA：乙酰辅酶A；

OAA：草酰乙酸；αkg：α-酮戊二酸；Glu：谷氨酸；Mal：苹

果酸；PC：丙酮酸羧化酶

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第四章 微生物次级代谢与调节

1、次级代谢产物：某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在菌生长终止后合成的。其生物合成至少有一部分是与核内和核外的遗传物质有关，同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。

2、初级与次级代谢途径相互连接 次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的

修饰初级代谢中间体的三种生化过程 生物氧化与还原、生物甲基化、生物卤化

3、前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化有些还具有促进产物合成的作用。

中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，他们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。

4、次级代谢物生物合成的原理

①一旦前体被合成，在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。 ②在某些情况下单体结构单位被聚合，形成聚合物。这些特有的生物合成中间

体产物需做后几步的结构修饰，修饰的程度取决于产生菌的生理条件。有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。

第五章 发酵培养基

1、培养基通常指人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料，同时，培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必需的环境条件

培养基提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机盐、生长因子、水和氧气等

2、工业发酵培养基的要求 ：

①培养基能够满足产物最经济地合成

②发酵后所形成的副产物尽可能的少

③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。

④所用培养基应能满足总体工艺的要求，如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等。

3、工业上常用的碳源：葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖

工业上常用的氮源：无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等。有机氮源：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。生理酸性物质，如硫酸铵。生理碱性物质，如硝酸钠。

提供生长因子的农副产品原料：

1) 玉米浆

2) 麸皮水解液

3) 糖蜜

4) 酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。

产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

4、发酵培养基的设计和优化方法 正交试验设计、均匀设计、响应面分析

正交试验设计：利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验结果的分析,了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。

正交实验数据分析，见教材P112-114例题，表4-16，同时确定因素的主次顺序、各因素的优水平、各因素水平的最优组合。小数点后保留一位。

响应面分析方法：适宜于解决非线性数据处理的相关问题，它囊括了试验设计、 建模、检验模型的合适性、 寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。

完整响应面分析方法实验设计通常包括：（1）Plackett—Burman实验设计 ，（2）最陡爬坡实验，（3）中心组合实验设计三个过程。

第六章 发酵培养基灭菌和空气净化 在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。

常用的灭菌方法有：干热灭菌法、火焰灭菌法、电磁波射线灭菌法、 湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）、化学药剂灭菌法、过滤除菌法等

1. 微生物热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间。

2.对数残留定律中各符号的意义。

3. 理论灭菌时间的计算

3.1间歇实罐灭菌时间的计算

3.2连续灭菌的灭菌时间计算：

4. 灭菌温度的选择：随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，培养基营养成分破坏的速度减慢。

高温瞬时灭菌法可以减少培养基营养成分的破坏的原理：

随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度增加较快，而培养基营养成分破坏的速度增加较慢。因此，采用较高的温度，较短的灭菌时间，可以减少培养基营养成分的破坏。

5. 影响培养基灭菌的因素 ：所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。

6.无菌空气：指通过除菌处理使空气中含菌量降低至一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。

7. 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。是大多数发酵厂广泛采用的方法。按除菌机制可分为： 绝对（表面）过滤和深层介质过滤 。

介质过滤除菌的机理：空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。

第七章 种子的扩大培养

1、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子

2、 种子扩大培养的目的与要求

（1）种子扩培的目的 ①接种量的需要 ② 菌种的驯化 ③缩短发酵时间、保证生产水平

（2）种子的要求 ①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短 ② 生理性状稳定③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染⑤保持稳定的生产能力。

3、种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积。

种子罐级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2～4级。

4、种子制备分两个阶段：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 好氧微生物菌种扩培常用设备：超净工作台、震荡培养箱、种子罐等。

5、种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

通常接种量：细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%

青霉素生产的种子制备过程：

安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵

第八章 发酵工艺控制

1、微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能和合适的环境条件。

2、发酵过程的代谢变化 从产物形成来说，代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化（培养基和培养条件）和产物形成速率这三者之间的关系。在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力学分为① 生长关联型 和② 非生长关联型。

3、发酵方式

（1）补料－分批发酵：指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。

低基质浓度的优点：① 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；② 克服养分的不足，避免发酵过早结束。

（2）半连续发酵：是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。

优点：① 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；② 克服养分的不足，避免发酵过早结束；③缓解有害代谢产物的积累。

（3）连续发酵：指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。在这样的环境中培养，菌的生长就受到所提供基质的限制，培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态。

与传统的分批发酵相比，连续培养有以下优点：

① 维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；

② 避免培养基积累有毒代谢物；

③ 可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间； ④ 便于自动控制。

4、发酵控制参数

按性质分类：物理参数、化学参数、生物参数

按检测手段分类：①直接参数：⑴在线检测参数 ⑵ 离线检测参数 ②间接参数

5、发酵热

发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。

Q发酵=Q生物+ Q搅拌- Q蒸发- Q显- Q辐射

生物热(biological heat)是菌体生长过程中直接释放到体外的热能，使发酵液温度升高。

搅拌热(agitation heat)是搅拌器引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。

6. pH值对发酵的影响

（1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈

代谢；

（2）影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；

（3）pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

7、引起发酵液pH值异常波动的因素

pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件

pH下降：

① 培养基中碳、氮比例不当。碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降；

② 消泡剂加得过多；

③ 生理酸性物质的存在，铵被利用，pH下降。

pH上升：

① 培养基中碳、氮比例不当。氮源过多，氨基氮释放，使pH上升；

② 生理碱性物质存在；

③ 中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。

8、临界氧浓度(critical value of dissolved oxygen concentration) ：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度。

呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以 Q O2表示，单位为mmolO2／(g干菌体·h)。

耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmol O2／(L·h)。

9、引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：

① 污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显；

② 菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；

③ 某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。

10、 泡沫的形成及其对发酵的影响

在大多数微生物发酵过程中，通气、搅拌以及代谢气体的逸出，再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在，培养液中就形成了泡沫。 形成的泡沫有两种类型：

一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；

另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluid foam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限

大量的泡沫引起的负作用：

发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小；

增加了菌群的非均一性；

造成大量逃液，增加染菌机会；

严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶； 消泡剂的添加将给提取工序带来困难。

泡沫的消除

调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。

采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。 采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。

常用的消泡剂有4大类： 天然油脂类、脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类

11、造成染菌的主要原因 设备渗漏 空气带菌 种子带菌 灭菌不彻底 技术管理不善

第九章 生物反应动力学

1.微生物反应动力学

研究各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间而变化的规律。

具体研究内容：微生物生长过程中质量的平衡；发酵过程中菌体的生长速率、

基质消耗速率和产物生成速率的相互关系 ；环境因素对这三种速率的影响。

2. 分批发酵工艺中缩短和消除延迟期的方法有：

增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。

3. Monod方程的参数求解：

µ= KS+S

S:限制性基质浓度mol/m3；KS:饱和常数mol/m3

例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：

S(mg/l) 6 33 64 153 221

μ(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70

利用MONOD方程作图如下，求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，KS和td

?

解：据图可知，：

1/µmax=0.95；KS/µmax=90；根据

可以求得：

μmax＝1.1 (h-1);

KS＝99mg/L，

td＝ln2/μmax＝0.63h

4. 连续培养动力学

稀释率：单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率

5. 细胞的物料平衡

单级连续培养的细胞物料平衡方程如下：

根据单级连续培养的细胞物料平衡方程，按照比生长速率μ和稀释率D的大小关系，讨论培养罐内细胞浓度和营养物质浓度的变化情况。

答：

μ > D: 则 dX/dt >0，培养罐内细胞浓度不断增加，营养物质浓度随之减少 μ

μ = D：则dX/dt =0，细胞浓度不随时间而变化，即培养达到稳定状态。

6. 限制性基质的物料平衡

临界稀释率（DC）: 发生洗出时的稀释率。

操作的稀释率不是可以随意改变的，而有一个限度。超过此稀释率时连续培养就无法进行，临界稀释率取决于加料中的限制性基质浓度，即细胞在此培养基中能达到的最大比生长速率。DC= μmS /(KS+S)

第十章 下游加工过程概论

1、下游技术（工程） （downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。

2. 发酵液的特点

1）含水多，产物含量低；

2）含菌体蛋白；

3）溶有原来培养基成分；

4）相当多的副产物和色素；

5）易被杂菌污染或使产物进一步分解；

6）易起泡，粘性物质多。

3、整个下游加工过程应遵循下列四个原则

1) 时间短；2) 温度低, （选择在生物物质的温度范围内）；3) pH适中;4) 严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角）。

4、一般下游加工过程可分为4个阶段

1)培养液（发酵液）的预处理和固液分离；2)初步纯化（提取）；3)高度纯化（精制）；4)成品加工。

5、下游加工过程的一般流程

第十二章 发酵液的预处理和固液分离方法 1、改善发酵液过滤特性的物理化学方法：

调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。

2、凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝 AlCl3•6H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO4·7H2O ；

石灰；ZnSO4；MgCO3

絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。工业上使用的絮凝剂可分为三类：

1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；

2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；

3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。

目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物

3、杂蛋白的去除方法有沉淀法、变性法 、吸附法

4、固液分离的方法：重力沉降、浮选、旋液分离、介质过滤、离心。

5、根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。

第十三章 细胞破碎

1、细胞破碎的阻力：

细菌破碎的主要阻力:肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；

酵母细胞壁破碎的阻力:主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；

霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。

2、常用破碎方法

机械法：珠磨法（固体剪切作用）、高压匀浆法（液体剪切作用）、超声破碎法（液体剪切作用）、X-press法（固体剪切作用）。

非机械法：酶溶法（酶分解作用）、化学渗透法（改变细胞膜的渗透性）、渗透压法（渗透压剧烈改变）、冻结融化法（反复冻结-融化）、干燥法（改变细胞膜渗透性）

3、破碎率的测定方法

1）直接测定法

2）目的产物测定法

3）导电率测定法

第十四章 沉 淀 法（Precipitation）

1、固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物溶解度降低，以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术。

结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体称为结晶法。

沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体称为沉淀法。常用的沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。

2、盐析(Salt induced precipitation)：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。原因如下：

1）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；

2）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；

Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；

常用的盐析用盐： 硫酸铵、硫酸钠，磷酸盐，柠檬酸盐。

3、有机溶剂沉淀：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

原理：

（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

常用的有机溶剂沉析剂：

乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；

丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；

4、等电点沉淀：调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称

为等电点沉淀。

原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

第十五章 膜 过 滤 法

1、膜过滤法指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法。基本原理是筛孔分离过程。在压差的推动下，原料液中的溶剂和小的溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧，所得到的液体一般称为滤出液或透过液，而大的粒子组分被膜截留。包括微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）四种过程。 在工业上用得最广的膜材料是醋酸纤维素和聚砜。

浓差极化：当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，使膜面浓度增大，并高于主体中浓度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。在超滤中，为减少浓差极化，通常采用错流操作。

膜的污染：膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象。 污染原因：膜与料液中某一溶质的相互作用；吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用。

膜污染的消除：污染必须通过清洗的办法才能消除。经清洗后如纯水通量达到或接近原来水平，则认为污染已消除。

减轻膜污染的方法

1）预处理

2）改变膜的表面性质

市售的超滤器大致有四种型式：管式、中空纤维式、螺旋卷绕式和平板式。

2. 将下列表示相同意义的词连线

separation factor 分离因子

membrane separation膜分离

ion-exchange 离子交换

Biotechnology生物技术

Metabolic Control fermentation 代谢控制发酵

Downstream Processing 下游工程

Chromatographic Resolution色谱分离

Biocatalyst，生物催化剂

Orthogonal experimental design 正交实验设计

response surface analysis响应面分析方法

Inducible enzyme 诱导酶

末端代谢产物阻遏(End-product repression)

分解代谢产物阻遏(Catabolite repression)

代谢工程（metabolic engineering)

临界氧浓度(critical value of dissolved oxygen concentration)

补料分批培养（feed-batch culture， FBC）

细 胞 破 碎 Cell Disruption

高压匀浆法（High-pressure homogenization

盐析(Salt induced precipitation)

微滤(Microfiltration，MF)

超 滤 (ultrafiltration，UF )

反渗透（Reverse osmosis，RO）

纳滤(nanofiltration,NF)

正相色谱（Normal Phase Chromatography，NPC），

反相色谱（Reversed Phase Chromatography，RPC），

第十六章 溶剂萃取和浸取

1、溶剂萃取

利用一种溶质组分（如产物）在两个互不混溶的液相（如水相和有机溶剂相）中竟争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作的。

2、“相似相溶”原理分子之间可以有两方面的相似：一是分子结构相似，如分子的组成、官能团、形态结构的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有极性的和非极性之分，两种物质如相互作用力相近，则能互相溶解。与

水“相似”的物质易溶于水，与油“相似”的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。

3、分配定律和分离因数

（1 ）分配定律：在一定温度一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数。如果是稀溶液，活度可用浓度代替，则达到平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数。称之为分配系数K，

（2）分离因数

3、乳化和去乳化

乳化：一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。乳化的结果可能形成两种形式的乳浊液：一种是水包油型（O/W），另一种为油包水型（W / O）。

生产过程出现的乳浊液是水包油型（O/W），还是油包水型（W / O），主要由表面活性剂的性质决定。

4、双水相萃取：在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。

常用聚合物双水相系统：聚乙二醇－葡聚糖、聚乙二醇－无机盐系统

双水相萃取的优点：

1）使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；

2）适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；

3）亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。

第十七章 离 子 交 换 法

1、离子交换原理及分类

离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子材料。是一类带有官能团的网状结构的高分子化合物，其结构有三部分组成：不溶性的三维空间

网状骨架，连接在骨架上的官能团和官能团所带的相反电荷的可交换离子。骨架上的活性离子在水溶液中发生离解，可在较大的范围内自由移动，扩散到溶液中，同时，在溶液中的同类型离子也能从溶液中扩散到骨架的网格或孔内。当这两种离子浓度差较大时，就产生一种交换的推动力，使它们之间产生交换作用，利用这种浓度差的推动力使树脂上的可交换离子发生可逆交换反应。 树脂按活性离子分类，活性离子是阳离子（和阳离子发生交换）就称为阳离子交换树脂；如果是阴离子，则称为阴离子交换树脂。

2、树脂的命名

根据离子交换树脂官能团的性质，将其分为强酸(0)、弱酸(1) 、强碱(2) 、弱碱(3) 、螯合(4) 、两性(5)及氧化还原(6)等7类。

3、离子交换树脂的理化性能指标

1）外观；2）交联度；3）化学稳定性；4）机械强度；5）交换量

4、影响离子交换树脂选择性的因素

1）离子价数

离子交换树脂总是优先选择高价离子，而低价离子被吸附时则较弱。

阳离子被吸附的顺序为：Fe3+ >Al3+ >Ca2+ >Mg2+ >Na+ ，

阴离子顺序为：柠檬酸根>硫酸根>硝酸根

2）溶液浓度的影响

树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大，而在浓溶液中选择性较小。

3）离子的水化半径

水化半径较小的离子优先吸附。

4）有机溶剂的影响

有机溶剂会使树脂对有机离子的选择性降低，而容易吸附无机离子，可利用有机溶剂从树脂上洗脱难洗脱的有机物质。

5）树脂与交换离子间的辅助力

凡能与树脂间形成辅助力，如氢键、范德华力等辅助力的离子，树脂对其吸附力就大；反之，能破坏这些辅助力的溶液就能容易地将离子从树脂上洗脱下来。

5、离子交换树脂的工作过程：

1）树脂预处理：新树脂装入柱后，先用去离子水浸泡12h左右，使树脂充分吸水膨胀，再用2-3倍树脂体积的10%左右食盐水浸泡4h以上。用水洗净残留的

NaCl，再根据树脂类型和使用所需要的型号分别用酸和碱处理，最后调pH值至所需范围。

2）上柱交换交换方式：采用顺流和逆流进行

3）洗脱：用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目的产物。

4）树脂的再生：先用清水洗涤，然后用再生剂再生，最后用清水洗至所需pH值。

6. ISEP系统是一种连续的离子交换系统

目前已成功的应用在各种不同的产业领域中。ISEP系统采用多柱(20/30交换柱)吸附以及在稳定状态下连续运行。不需要备用设备；离子交换树脂的再生也不必中断正常的生产。

ISEP系统可以处理杂质浓度较高的物料，保证产品具有稳定的成分和浓度；采用多通道逆向流动再生方式，减少了离子交换树脂及、再生剂和洗涤水的用量。 工作过程：

交换：利用ISEP离子交换系统，对膜滤液中的赖氨酸离子进行吸附，与其他杂质分离，吸附分离下来的废水及杂质排出柱体，吸附饱和的柱体进入洗脱回填区。

回填：通过洗脱液回填压出柱体内的废水和杂质，以提高洗脱液纯度。

洗脱：利用一定浓度的氨水消除酸性，将赖氨酸离子从树脂上解析下来，并使树脂得到再生。

转型：再生柱进入再生区经过稀硫酸转型后在吸附区达到最佳的吸附能力。

第十八章 色谱分离法

1、色谱分离（Chromatographic Resolution，CR）利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。

特点分离效率高；检测能力强；样品用量少；适用范围广。

2.色谱分离过程：

两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。

3. 检测器

UV-Vis、荧光、电化学、蒸发光散射、示差折光、质谱等检测器。

4. 色谱时间

死时间（Dead time）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。

保留时间（Retention time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。

调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，

5. 气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。

6. 液相色谱：

首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

4. 凝胶色谱介质常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。 分类

吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。

分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。 离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。

凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular Sieve Chromatography，MSC）、空间排

阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。

第十九章 蒸发、蒸馏和结晶

1、真空蒸发：冷凝器和蒸发器溶液侧的操作压力低于大气压、此时系统中的不凝性气体必须用真空泵抽出。

目的：降低溶液的沸点。

优点：

(1)溶液沸点低，可用温度较低的低压蒸汽或废蒸汽作加热蒸汽。

(2)溶液沸点低，同样蒸汽所需的传热面小。

(3)沸点低，有利于处理高温下易分解和变质的热敏性物料。

(4)蒸发器的操作温度低，系统的热损失小。

2、多效蒸发：第一个蒸发器(称为第一效)中蒸出的二次蒸汽用作第二个蒸发器(第二效)的加热蒸汽，第二个蒸发器蒸出的二次蒸汽用作第三个蒸发器 (第三效)的加热蒸汽，依此类推。

3、蒸发器的分类：分为膜式蒸发器和非膜式蒸发器两大类。膜式蒸发器又分为升膜蒸发器、降膜蒸发器、旋转刮板蒸发器、板式蒸发器。

4、酒精发酵醪液蒸馏的理论基础是拉乌尔定律。

拉乌尔定律：混合液中，蒸气压高的组分，在气相中的含量总是比液相中的高；反之，蒸气压低的组分，在液相中的含量总是比气相中的高。

5、饱和曲线和过饱和曲线

饱和溶液：溶液恰好饱和，溶质既无溶解也无结晶，即溶质与溶液处于平衡状态，此溶液称为饱和溶液；

未饱和溶液：若添加固体则固体溶解；

过饱和溶液：超过饱和点的溶质迟早要从溶液中沉淀出来。

要使溶质从溶液中结晶出来，须首先使溶液成为过饱和状态，也即必须设法产生一定的过饱和度作为推动力。

6、

溶液的过饱和度与结晶的关系：

AB为饱和曲线；CD为过饱和曲线。

AB和CD将图分为：稳定区、介稳区和不稳区。

稳定区：溶液尚未饱和，没有结晶的可能。

介稳区：也不会自发产生晶核，但如已有晶核，则晶核长大而吸收溶质直至浓度回落到饱和线上。

不稳区：能自发产生晶核。

如E点是溶液的原始末饱和状态， E H是冷却结晶线，F点是饱和点，不能结晶，到达G点时，自发产生晶核。

7、结晶包括三个过程：形成过饱和溶液；晶核形成；晶体生长。

8、接触成核(碰撞成核)：新生的晶核是晶浆(有晶体存在的结晶溶液)中已有的晶体颗粒，在结晶器中与其他固体接触碰撞时产生的晶体表层的碎粒。其中较大的就是新的晶核。

优点：

①动力学级数较低，即溶液过饱和度对成核影响较小。

②在低过饱和度下进行，能得到优质结晶产品。

③产生晶核所需要的能量非常低，被碰撞的晶体不会造成宏观上的磨损。 在工业生产中，接触成核有以下4种方式：

(1)晶体与搅拌螺旋桨间的碰撞；

(2)湍流下晶体与结晶器壁间的碰撞；

(3)湍流下晶体与晶体的碰撞；

(4)沉降速度不同，晶体与晶体的碰撞。

其中以第1种方式为主。

第二十章 典型发酵产品介绍

1、酿造酒包括黄酒、啤酒、葡萄酒，酒精含量比较低。蒸馏酒主要指白酒、白兰地等。蒸馏酒的酒精含量高。

2、红葡萄酒：用果皮带色的葡萄带皮发酵制成，酒色呈深红、鲜红、紫红或宝石红。

白葡萄酒用白葡萄或红皮白肉葡萄的果汁制成，酒色呈浅黄、禾秆黄、金黄色或近似无色。

3、白兰地商标上的英文缩写：X.O（Extra Old）酒龄（即贮陈期）规定不低于10年。

4、啤酒生产中麦汁煮沸的目的：蒸发水分，浓缩麦汁；钝化全部酶和麦汁杀菌；蛋白质变性和絮凝；酒花有效组分的浸出；排除麦汁中特异的异杂臭气。

5、白酒的四大香型：

米香型：桂林三花酒；发酵完成后经过反复二至三次蒸馏，酒精度数较高， 民间过去叫“三蒸酒”、“三熬酒”。酿酒师们总结出了“观花论酒”的经验。当酒度在55°至 60°时，由于液体表面张力，酒面晃动便泛起数层酒花，经久不散。酿酒师们说“起花了，三花！”就接酒。

酱香型 （茅型酒）茅台酒；原料为高粱，曲为纯小麦制高温曲，八次蒸料，八次下曲，八次发酵，八次蒸馏（但仅取酒7次，因为第一次蒸馏出的不作正品，泼回酒窖重新发酵）。

浓香型 （庐型酒）：庐州老窖——产于四川泸州市。千年窖，万年糟，传统的老五甑生产工艺，混蒸，主体香为己酸乙酯。。纯小麦制大曲，以糯玉米为原料。根据酒的质量可分特曲、头曲、二曲和三曲。五粮液采用五种粮食（高梁、大米、糯米、小麦、玉米）为原料。

清香型 （汾型酒）：汾酒——产于山西汾阳县杏花村，二次发酵二次勾兑。前次发酵21天，蒸馏，加酒糟，再发酵21天，再蒸馏。清蒸二次清工艺，乙酸乙酯和乳酸乙酯两者的结合为主体香。

6、青霉素生产工艺 青霉素簇和头孢菌素簇是临床上最为重要的抗生素，属于β-内酰胺类抗生素。 青霉素(Benzylpenicillin / Penicillin)是指分子中含有青霉烷酸，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。

青霉素的生物合成过程：

在青霉素发酵中，已知产黄青霉利用葡萄糖和氨，经由a—氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸在三肽合成酶的催化下合成三肽，异青霉素N合成酶催化发生环化生成异青霉素N，再与苯乙酸、苯乙胺、苯乙酰胺、苯乙酰甘氨酸等在异青霉素N酰基转移酶催化进行转酰基反应，产生青霉素G 。

（1）常用菌种为产黄青霉。

（2）青霉素G的合成途径

（2） 发酵工艺

冷冻管→斜面母瓶25℃，6～7d大米孢子25℃，6～7d

一级种子罐25℃，40～45 h，1:2VVM二级种子罐

种子培养发酵发酵罐25℃，13～15 h，1:1.5VVM22～26℃，6～7d，1:1～0.8VVM种子培养孢子培养孢子培养

放罐冷至15℃至提炼

（3）发酵控制

①加糖控制一般在残糖将至0.6％左右，pH上升时开始加糖。

②补氮及加前体加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.01～0.05％。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05～0.08％。

③pH控制加酸或碱自动控制pH，一般为6.4～6.6。

④温度控制一般前期25～26℃，后期23℃，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。

⑤通气和搅拌抗生素深层培养需要通气与搅拌。

⑥泡沫和消泡可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙稀环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加入。

⑦过滤宜采用鼓式真空过滤器。过滤前加去乳化剂降温。

⑧提炼采用溶媒萃取法，醋酸丁酯（BA）作溶媒。

⑨脱色采用活性炭进行脱色。过滤。

⑩共沸蒸馏或直接结晶

7. 酶制剂的生产方法：固态发酵法和深层液体培养法

7.1利用微生物产酶的优点

（1）微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。

（2）微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。

（3）微生物培养基来源广泛、价格便宜。

（4）可控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化。

（5）可以利用现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种

枯草杆菌BF-7658液体深层发酵生产α-淀粉酶的发酵控制：

工艺流程：

A种子制备：

孢子培养一般采用马铃薯培养基，于37℃下培养72 h，使菌体全部形成孢子即为成熟。

种子培养维持罐温37℃，罐压0.5～0.8 atm，10h后加大通风，当菌体处于对数生长期后期，立刻接种至大罐，种子培养一般14h左右。

发酵控制：

通常采用低浓度发酵和高浓度补料的方法，

优点：低浓度可以避免原料中淀粉降解生成的糖过量堆积而引起分解代谢阻遏，有利于pH值控制，延长产酶期。

温度37℃，罐压0.5 atm，通气量0～12 h控制0.5～0.6 VVM，12 h后控制在0.8～1.0 VVM，发酵后期控制在0.9 VVM。

补料体积和基础培养基体积一般为1:3左右。从10 h左右开始补加，一般前期、后期少，中期大，根据菌体的生长情况来调整。当pH低于6.5，细胞生长粗壮时可酌减；当pH高于6.5，细胞出现衰老并有空胞时可酌增。

停止补料后6-8h，温度不再上升，菌体衰老（80%菌体形成空胞），酶活不再提高，发酵即可结束。发酵周期一般为40 h。

提取：工业上回收α-淀粉酶一般采用硫酸铵盐析法。

8. 二步发酵法生产维生素C工艺有酸转化工艺和碱转化工艺两种。

维生素C（2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯 ）的合成方法主要有莱氏化学合成法和微生物发酵合成法两种。

酸转化设备简单、流程短，但制得的维生素C破坏严重、质量差，设备腐蚀严重，三废多，因此逐渐淘汰。

碱转化虽然流程较长、投资大，但产品质量好，故目前绝大部分工厂均采用碱转化工艺。

1985年转让二步发酵法生产维生素C工艺给世界上生产维生素最大企业－瑞士霍夫曼•罗氏制药公司。——我国医药工业史上首次出口技术。

二步发酵法反应步骤：

二步发酵法的整个生产工艺流程可分为发酵、提取、转化和精制四部分 二步发酵：

第一步发酵中所用菌种为生黑葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter melagenus），简称黑醋菌。最常用的生产菌株为R-30；

第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans），工业生产过程中使用最多的大菌为2980及152混合菌。

9.谷氨酸发酵

菌种主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。这些菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。

谷氨酸发酵过程

1 发酵初期，即菌体生长的迟滞期

糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略有上升，一般为2～4h。 2 对数生长期

代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升，但随着氨被利用pH值又下降；溶氧浓度急剧下降，然后又维持在一定水平上；菌体浓度（OD值）迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5～8.0，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵热，故必须进行冷却，使温度维持30～32℃。菌体繁殖的结果，菌体内的生物素含量由丰富转为贫乏。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。

3 谷氨酸合成阶段

当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。

4 发酵后期，

菌体衰老、糖耗缓慢、残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸浓度不再增加时，需及时放罐。

发酵周期一般为30多小时。

谷氨酸提取的新工艺

10 柠檬酸的发酵生产工艺

以糖质原料发酵生产柠檬酸的常用菌种是黑曲霉

黑曲霉柠檬酸的积累机制总结

1) Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高，解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；

2) 丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，可以不断地提供草酰乙酸。同时组成型柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。

3) 控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，柠檬酸进一步代谢减少，使柠檬酸积累；

4) 柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。

发酵操作方法分为不置换法和置换法两种。

柠檬酸提取方法

考试题型：

填空题10题共10分；选择题10题共10分；判断题10题共10分，英汉词语对照10分；简答4题20分；分析讨论题2题10分；应用题（计算题和工艺流程及发酵控制）2题或3题共30分；