髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳腺炎的研究

髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳腺炎的研究

郭昌明 张乃生*

(吉林大学畜牧兽医学院，吉林 长春 130062)

摘要：本文着重论证了对奶牛奶样中髓过氧化物酶（myeloperoxidase ，MPO ）的检测诊断隐性乳腺炎的可行性。就乳腺炎的发生和发展过程中的生理生化指标的变化特点及乳腺炎指示物MPO 进行了系统的论述。奶样中的体细胞数（SCC ）和ELISA 检测MPO 浓度得出的相关系数值为0.91, 奶样中随着SCC 的增高，MPO 的水平也增高能够达到2000 ng/ml。分析MPO 单克隆抗体（AM Mo abs）最适浓度和最适培养浓度，检测奶样中MPO 的浓度范围为2－1000 ng/ml。 在SCC 和MPO 浓度都高的奶样中都可以分离到大量细菌。免疫学分析MPO 单克隆抗体与乳铁蛋白、乳过氧化物酶、牛血清白蛋白、髓过氧化物酶、淋巴细胞、少量体细胞的乳样之间的ELISA 反应没有交叉性, 表明MPO 分子在乳腺炎中具有很高的特异性。通过对奶牛奶液中MPO 的检测来判断乳房内中性粒细胞（PMN ）的活性状态，就可以早期诊断奶牛是否患有隐性乳腺炎。针对MPO 的单克隆抗体，本文对AM Mo abs的特异性、交叉性、灵敏度进行了详细论证。从而得出检测奶牛乳汁中MPO 的量可以诊断隐性乳腺炎。

关键词：隐性乳腺炎， MPO ， 单克隆抗体， ELISA 检测

Study on the myeloperoxidase detecting recessive mastitis

GuoChangming ZhangNaisheng ZhouChangfang YangZhengtao WaiDong JingZhao

To evaluate the potential of using MPO in the diagnosis of udder infections in dairy cattle we developed a specific enzyme immunoassay for bovine MPO in milk. The change of physio-biochemical indicator and the indicator MPO in the development of mammitis are systematically discussed. .For the milk samples the correlation coefficient between the somatic cell count and MPO concentrations determined using the ELISA was 0.91. In milk samples with a high SCC,MPO levels were also high, reaching levels of ca.2000 ng/ml .Optimum antibody concentrations and optimum incubations were determined by conducting checker-board titrations. The range of measurement was ca.2-1000 ng/ml using purified MPO as standard.. Microorganisms were isolated in the milk samples with elevated concentrations of MPO and high SCC. According to immunoblot and ELISA analysis, the AM Mo abs are specific to bovine MPO and show no cross reactivity with other neutrophil granule proteins such as lactoferrin, lactoperoxidase and serum albumin. The result showed MPO is good very specificity in milk about mastitis. precision and accuracy in measuring MPO in milk .Judged MPO in milk ,it be used to assess PMN active condition in intra-breast of bovine. The specificness ，crosswise and sensitivity of AM Mo abs were Argumented in full in this article. The results clearly show that the quantitative analysis of the amount of MPO in mastitis milk can be used to detect intramammary recessive infections in dairy cattle. 作者简介：郭昌明，男，1980年出生，内蒙古集宁人，硕士学位，吉林大学畜牧兽医学院临床兽医系。研究方向为动物营养代谢病与中毒病。＊为通讯作者

地址：长春市西安大路5333号吉林大学畜牧兽医学院临床兽医系，邮编130062。电子邮箱：[email protected]

联系电话：[1**********] （0431）6758371。

key words: recessive mastitis myeloperoxidase monoclonal antibody enzyme linked

immunosorbent assay

奶牛乳房炎是世界乳牛业的主要危害因素之一。它不仅影响奶牛的产奶量，严重时使奶牛遭到淘汰，甚至还影响乳的品质，危及人类健康。据报道，国外奶牛乳房炎的发病率约为20%一60%，美国每年因乳房炎引起的直接经济损失超过20亿美元; 而国内奶牛乳房炎的发病率大约是20%一70%，其直接经济损失也不少于21亿人民币。据资料记载，临床型乳腺炎占奶牛总发病率的21－23%，其淘汰牛占奶牛总淘汰率的9%-10%。隐性乳腺炎流行面广，为临床型乳腺炎的1540倍，引起奶产量降低4%-10%,影响牛奶质量，并易转变为临床型乳腺炎。因此，我们应该研究一种方便快捷、可推广的检测方法对患乳腺炎的奶牛乳汁进行检测并作出早期诊断，对减少奶牛业经济损失具有重要意义[1]。

国内外奶牛隐性乳腺炎的检测方法有SCC 检测法[2]、手握式导电仪检测法[3]、凝固酶试验TCT 、单克隆抗体的免疫方法检测[4]、DNA 指纹图技术检测法[5]、 PCR 检测法等，在我国奶牛养殖情况下很难得到广泛的应用，有许多方法还要求专业实验室操作，这对推广应用是不利的，有些方法临床应用时不够快速、简便地作出诊断。所以需要找出一种快速、简便、准确的方法在临床上能够广泛地推广。应用现今先进的ELISA 试剂盒和试纸条技术来检测奶牛隐性乳腺炎的方法是一个新的快速便简诊断思路。随着现代生物技术的发展，对疾病的检测深入到分子水平，应用单抗技术通过ELISA 方法或试纸条显色法对疾病进行检测。髓过氧化物酶可作为奶牛隐性乳腺炎的指示性物质，我们可以通过MPO 的研究对奶牛隐性乳腺炎的检测上升到分子水平。关于奶牛乳腺炎的MPO 研究国内还未见报道，在国外瑞典的国家兽医研究所1994年分别报道了奶液中MPO 是乳腺炎的指示性酶类物质、奶牛MPO 的单克隆抗体的制备及针对奶牛乳汁中MPO 的MPO-ELISA 方法的建立。 1 乳房炎的发病机理

乳房炎是一种复杂的疾病，其病原菌很多，它的发生是病原、机体防卫功能和外界环境因素共同作用的结果。葡萄球菌和链球菌占病原菌总数的90%以上，是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌。病原菌数中所占的比例依次为停乳链球菌(40.91 %)、金黄色葡萄球(27.28 %)、无乳链球菌(13.64 %)、乳房链球菌((9. 09 %)、大肠杆菌((9. 09 %).此外，支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎[6]。

乳腺炎时白细胞--凭借其渗出性、变形性、趋化性及吞噬功能等生理特性而扑捉杀灭乳腺组织中或乳房中的病原体。中性粒细胞具有高度活动性，能挤过毛细血管的微孔进入身体组织之内，这种功能称为渗出。当抗原进入体内时，引起化学物质的释出而吸引各类中性粒细胞进入入侵区域，称为趋化性，可引起其趋化作用的物质计有C3a 、C5a 、C567、由活化的淋巴细胞释放的淋巴因子、生物细菌所释放的代谢产物、组织分解产物、吞噬细胞所释放的物质[7]（如髓过氧化物酶等）。中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞能包围和吞噬入侵的有机体微生物，这一过程称为吞噬作用。被激活的白细胞可释放：颗粒酶体内容物、花生四烯酸代谢产物、氧代谢产物、细胞因子等介质以诱发炎性反应并参与炎症反应。被激活后的白细胞释放两种颗粒：含有髓过氧化物酶及弹性酶的嗜苯胺篮体（初级颗粒）和含有乳铁素的特异颗粒（次级颗粒）。髓过氧化物酶及乳铁素主要参与依赖氧的杀菌活动[8]，乳铁素为氧自由基的产生提供绝大部分的铁。激活后的白细胞释放弹力酶降解弹力素及纤维。弹力酶还影响内膜细胞的连接，促进血液蛋白的渗出。与此同时还有其它一些

，乳腺炎蛋白酶类[9]如：过氧化物酶、凝固酶、C －反应蛋白、间质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）

时上述各种物质都存在于乳腺炎症部位和奶汁中。还有氯化物等炎症盐份和无机离子也从炎性区浸出增加，乳腺上皮细胞脱落增加。破坏的腺泡组织由结缔组织及疤痕组织所代替。

国内外对奶牛隐性乳腺炎乳汁的SCC 法和卤化物检测法研究较多，对髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳腺炎研究国内没有，国外只有瑞典和德国有报道。

2 髓过氧化物酶是奶牛乳腺炎的指示物

奶牛的髓过氧化物酶(myeloperoxidase\MPO)是多形核粒细胞、单核细胞、巨噬细胞释放的嗜天

青颗粒的主要成份，并在炎症过程中扮演了吞噬和溶菌的重要角色，成熟的牛MPO 是一种亚铁血红素糖蛋白，它的结构是四聚体，两重链大小分别为60kDa ，两轻链分别为15 kDa，牛MPO 的分子量为150 kDa 。已经确定的牛的MPO 三种形式（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）,MPO 在哺乳动物体内抵抗微生物作用已得到证实。用一种特异的ELISA 方法检测牛奶中MPO 来诊断乳腺炎，对此瑞典的Cooray R.进行了精确的评估。ELISA 用了两种特异性抗体，MPO 单克隆抗体和MPO 多克隆抗体。总共对141份奶样的体细胞数和ELISA 检测MPO 浓度得出的相关系数值为0.91, 奶中MPO 的ELISA 结果显示了很好的精确性和准确度，精确值的变异总和为10%,结果很让人满意, 由此判断奶中的MPO 酶稳定性很好。85%的奶样中随着MPO 浓度增加分离的微生物的量也提高。在没有体细胞或很少的乳样中ELISA 没有检测出MPO ，有90%样品没有分离出微生物。结果清楚地说明分析奶汁中MPO 的量就可以确定奶牛是否感染隐性乳腺炎[10]。

2.1 MPO 浓度与吸光值关系

研究用的牛MPO 是经过精确测定了吸收光谱[11]、多肽亚单位结构、氨基酸组成、和过氧化物酶活性的标准品。通过方格板滴定分析MPO 单克隆抗体最适浓度和最适培养浓度，MPO 的检测浓度范围为2－1000 ng/ml（纯化的MPO 作为标准[12]）, 在405nm 波长的吸光度随MPO 浓度的增大其吸光值也增加，而且数据图表显示近似于直线关系。由此说明髓过氧化物酶MPO 作为奶牛乳腺炎的指示物可检测性。

2.2 乳汁中MPO 和其它成份的ELISA 反应交叉性

MPO 单克隆抗体与乳铁蛋白(LF)、乳过氧化物酶(LPO)、牛血清白蛋白(BSA)、髓过氧化物酶、淋巴细胞(Lym)、中性粒细胞(Neut)、少量体细胞的乳样之间的ELISA 反应没有交叉性。MPO 单克隆抗体与纯化的MPO 和从中性粒细胞提取的MPO 的反应能力很高。LF 100ng/ml , LPO 100ng/ml , BSA 100ng/ml , MPO 100ng/ml , Lym 100µl/well , Neut 100µl/well , Milk 100µl/well of milk samples containing between 5000 and 8000 SCC/ml与MPO- ELISA的交叉反应光谱吸收图。图－1中数据充分表明MPO 与MPO 单克隆抗体－ELISA 之间具有很高的特异性，而且七种物质与MPO －ELISA 交叉反应很低。

图－1

2.3 奶样中MPO 的浓度和体细胞数SCC 的相关性

在不同体细胞数SCC 的奶样中用ELISA 检测其中的MPO 量, 从而得出牛奶中的MPO 与SCC 的散点图和回归分析, 奶样中MPO 的浓度和体细胞数SCC 具有正相关关系，R ＝0.91。分析证明了

奶样中SCC 能作为隐性乳腺炎诊断依据，同样奶样中的MPO 量的高低也可作为隐性乳腺炎诊断依据，且具有很规律的正相关对照。如图－

2

图－2

2.4 奶样中的SCC 、MPO 浓度和分离的细菌量的关系

图－3中显示了具有代表性一组奶样的SCC 、 MPO 和分离细菌的量。奶样中随着SCC 的增高，MPO 的水平也增高能够达到2000 ng/ml。在SCC 和MPO 浓度都高的奶样中都可以分离到细菌，其中葡萄球菌占52％、乳房链球菌占32％、埃希杆菌属(大肠杆菌属) 占 6％。从表中可以看出感染细菌的奶样中的SCC 和MPO 量明显增多增高，从而能证明一点：当乳腺感染细菌引起乳腺炎时，奶液中的SCC 和MPO 指标在一定限度内升高。这个指标为检测奶样中MPO 量的范围来确定奶牛乳腺炎提供了依据。

奶牛隐性乳腺炎的早期诊断，寻找一种可行的检测方法意义重大。研究证明用MPO －ELISA 检测牛奶中的MPO 是一个方便可行的诊断乳腺炎方法。趋动到炎症感染部位的中性粒细胞PMN 会释放吞噬颗粒酶MPO ，通过测量奶样中MPO 的含量和活性，发现乳汁中MPO 的水平是诊断乳腺炎的很好指标。MPO －ELISA 检测奶样中MPO 的量和奶样中中性粒细胞数增多的相关分析，得出奶样中MPO 与体细胞数SCC 的相关系数R ＝0.91，乳汁中其它颗粒酶与SCC 的相关性都比MPO 低。可以说明MPO 在乳腺炎奶汁中具有很高特异性，我们发现根据MPO 浓度可以估计SCC 的最低量为100000/ml.

图－3

(O-没有细菌，Sa －葡萄球菌,Sru-乳房链球菌,Srd-停乳链球菌,Sra-无乳链球菌,Ec-埃希杆菌属(大肠杆菌属),Ap-酿脓放线菌,CNS-葡萄球菌凝固酶阴性。)

3 髓过氧化物酶单克隆抗体(AM Mo abs)的特异性

1994年，Ruby Cooray 等利用杂交瘤技术制备了奶牛MPO 的单克隆抗体，并对MPO 单克隆抗体的特异性、灵敏度、稳定性都做了研究和分析。从奶牛血清中的中性粒细胞PMN 中提取的髓过氧化物酶MPO 经过纯化作为免疫小鼠的抗原。用提纯的MPO 包被ELISA 微量滴定板检测小鼠产生的MPO 单克隆抗体的特异性。用快速G 蛋白琼脂糖凝胶纯化MPO 单克隆抗体。还对小鼠MPO 单克隆抗体的亚型IgG1 IgG2a IgG2b IgG3和IgM 进行了测定。以及MPO 单克隆抗体的等电点的测定[13]。

Ruby Cooray,Christer G.B.等制备了8株AM Mo abs的B 细胞交杂瘤细胞AM1-AM8, 它们都与MPO 三种色谱层析试验结果相似。通过MPO 单克隆抗体建立ELISA 和免疫印迹反应测定血清中和奶汁中的髓过氧化物酶。并通过ELISA 方法阐述了奶牛MPO 单克隆抗体的特异性和精确性，AM Mo abs与粒性白细胞（PMN ）的其它颗粒酶无交叉反应性。四种AM Mo abs亚型AM1 AM2 AM3 AM4所占比例很大。AM Mo abs与MPO 的任一位点或抗原决定簇结合都会影响髓过氧化物酶MPO 的活性作用。AM Mo abs只与中性粒细胞特异性反应，而不与淋巴细胞和上皮细胞结合反应。研究表明MPO 单克隆抗体可以探索检测奶牛乳腺感染炎症时的髓过氧化物酶MPO 含量和活性，据此可以早期作出奶牛隐性乳腺炎的诊断。

3.1 AM Mo abs －ELISA 特异性

AM Mo abs与MPO 的三种形式反应特异性很高，而与牛乳铁蛋白（BLF ）、牛乳过氧化物酶（BLPO ），牛血清折蛋白（BSA ）无反应。试验数据如表－

4

表－4

3.2 AM Mo abs抑制MPO 酶的活性试验

奶牛的髓过氧化物酶MPO 与MPO 的单克隆抗体结合后髓过氧化物酶活性会被抵消。AM Mo abs抑制MPO 酶的活性试验如下：用化学发光反应法对 MPO单克隆抗体AM Mo abs抑制纯化好的奶牛髓过氧化物酶MPO （50ng/ml）活性的能力检测。AM1、AM2、AM3、AM4四株MPO 单克隆抗体对MPO 活性都有抑制效果。在浓度为100ng/ml时AM Mo abs的化学发光值减少50－30％，不同株单抗AM Mo abs的抑制效果不同，化学发光值分别减少：AM1 42.8％、AM4 33.9％、AM2 24.7％、AM3 12.1％。Ruby Cooray,Christer G.B.的研究还证明同种型的单克隆抗体之间不会互相影响其活性。

结论:在乳腺感染炎症部位，MPO 被释放出来，所以乳腺炎症部位的MPO 水平多少可以作为被病原微生物刺激活化的标志，通过对奶牛奶液中MPO 的检测来判断乳房内PMN 的活性状态，就可以早期诊断奶牛是否患有隐性乳腺炎。

国内已报道了在人医临床上应用抗MPO 抗体的ELISA 检测血管炎和肾炎[14]、单克隆抗体MPO 在急性白血病鉴别诊断中的应用[15]，还报道了胶乳凝集法与酶联免疫吸附试验检测抗髓过氧化物酶抗体[16]；尝试用胶乳凝集法(LA ST ) 来检测MPO 抗体。

感染细菌乳腺炎的奶样中的SCC 和MPO 量明显增多增高，MPO －ELISA 检测奶样中MPO 的量和奶样中中性粒细胞数增多的相关分析，得出奶样中MPO 与体细胞数SCC 的相关系数R ＝0.91。当乳腺感染细菌引起乳腺炎时，奶液中的SCC 和MPO 量有一个限定性指标。这个指标为检测奶样中MPO 量的范围来确定奶牛乳腺炎提供了依据。其它颗粒酶与SCC 的相关性都比MPO 低。可以说明MPO 在乳腺炎奶汁中具有很高特异性。MPO 单克隆抗体与髓过氧化物酶MPO 、牛血清白蛋白、淋巴细胞、少量体细胞的乳样之间的ELISA 反应没有交叉性。经过分析MPO 单克隆抗体最适浓度和最适培养浓度，MPO 的检测浓度范围为2－1000 ng/ml（纯化的MPO 作为标准）。由此说明MPO 单克隆抗体用来检测奶牛乳腺炎的指示物髓过氧化物酶MPO 的特异性和准确度。AM Mo abs与粒性白细胞

PMN 的其它颗粒酶无交叉反应性，AM Mo abs亚型AM1 AM2 AM3 AM4所占比例很大而且同种型的单克隆抗体之间不会互相影响其活性。所以制备奶牛MPO 单克隆抗体，建立MPO-ELISA 检测试剂盒和检测试纸条直接检测奶样对奶牛隐性乳腺炎的早期快速诊断是完全可行的。

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