慢病毒载体构建及结构优化

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其次．采用一种含有拯救ｒＡＡＶ基因组的细胞株，又提高了包装效率５倍ｏ］。Ｍａｍｏｕｎａｓ等报道运用Ａｄ５多聚赖氨酸一转铁蛋白一ＤＮＡ—Ａｄ８复合物感染Ｈｅｌ，ａ细胞，可使转导效率提高近２４５倍“…。

Ｉ，ｅｂｋｏｗｓｋｉ等将ＡＡＶ的ｒｅｐ和ｃａｐ基因转染入

能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞；③它的内源性弱启动子对外源基因的调控无明显的干扰作用；且启动的方向不指向宿主细胞ＤＮＡ．因此通过插入病毒启动子而激活细胞原癌基因的可能性极小；④其基因组结构极为稳定．有利商业开发；⑤可以口服给药，使给药方式更加方便“”。尽管ＡＡＶ的一些生物学特性尚待阐明．ＡＡＶ载体在体内能否定向整合尚待明确，但现有资料使人们有理由相信ＡＡＶ载体将是未来基因转移中最有希望的新一代病毒载体之一。

参考

ｌ

２９３细胞．建立了ｒＡＡＶ包装细胞系，也增加了病毒

的滴度。

纯化ＡＡＶ病毒的传统方法是加热失活法和平衡密度梯度离一Ｃ２法。为了获得高滴度的ｒＡＡＶ载体用于临床实验．Ｆａｎ等用增加ｒｅｐ—ｃａｐ质粒拷贝数来增加产量，但需要仔细调节Ｒｅｐ７８／６８的水平”“。Ｈｅｒｍｅｎｓ用ｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度梯度离心法取代Ｃｓｃｌ法，缩短了离心时间，获得了高浓度的ｒＡＡＶ，减少了Ｃｓｃｌ对病毒的毒性作用口“。对于ＡＡＶ一２而言，由于存在细胞表面受体，所以能用亲和层析法纯化，避免了Ｃｓｃｌ和帮助者病毒的污染。这些细胞表面受体包括硫酸乙酰酣素糖蛋白受体、联合辅助受体、ｎＶ口５整合素受体和人ＦＧＦ受体““。

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内高效、稳定、足量、长期的表达。已有研究表明ｒＡＡＶ能够在动物体内超过１８个月的表达。除了采用更强的启动子和增强子来取代常用的ＣＭＶ、ＳＶ４０启动子之外，缺氧（＜０．０１％ｏ。）［１“、紫外线‘１“、羟基脲、ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＰＦＣ）ｌｉｑｕｉｄｓ““、细胞因子、肿瘤坏死因子ｅｔＤ７］等也可提高目的基因的表达。

综上所述，ＡＡＶ作为载体有许多优点：①它是一种非病原微生物，与已知的人类疾病无关；②它既

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慢病毒载体构建及结构优化

李振宇综述徐开林潘秀美审阅

徐州医学院附属医院血液科（徐州，２２１００２）

。１

／ｑ

摘要慢病毒载体目前是基因治疗中研究较多的载体，与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较，它

有感染非分裂期细胞及容纳外源性目的基因片段大等优点．对其结构的优化主要集中在提高生物安全性、提高转

基因表达、转基因表达的调控及载体靶向性等方面．本文介绍了慢病毒载体构建及结构优化方面的研究进展作一

综述．

关键词慢病毒载体；载体构建；结构优化

目前基因治疗中目的基因的转移工具多采用病毒载体，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为

常用。由于逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的ＤＮＡ片段长度不超过８ｋｂ；腺病毒

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载体感染细胞时，病毒ＤＮＡ游离在细胞核内．并不整合到染色体上，在体内不能实现稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。以人类免疫缺陷病毒一１（ＨＩＶ—１）来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视［１］。研究发现慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞．人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外，慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大．可以在体内较长期的表达，免疫反应小，安全性较好。近来，慢病毒载体的研究进展迅速，但欲应用于临床尚需对其进一步加以改造，以进一步提高生物安全性、提高目的基因的表达及调控目的基因的表达。

高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整台所需的顺式序列．还保留

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ｂｐ的ｇａｇ和ＲＲＥ，并在其中插入目的基因或标

志基因（绿色荧光蛋白ＧＦＰ）。将载体系统分成三个质粒最大的益处是使序列重叠的机会大大减少，减少载体重组过程中产生ＲＣＶ的可能性。通过三质粒共转染２９３Ｔ细胞。超速离心后病毒滴度可达１０９

ｌＵ／ｍｌ。

１．３四质粒表达系统

为了减少Ｈｌｖ—ｌ包装结构的序列同源性，进一步减少重组成ＲＣＶ的可能性，Ｄｕｌｌ［５３等人将辅助基因去除。但由于ｇａｇ—ｐｏｌ的转运需要ｒｅｖ，因此，在上述的三质粒系统的基础上，构建成四质粒表达系统，该系统加上含ｒｅｖ的质粒减少了产生ＲＣＶ的可能性，而且对非分裂期细胞转导效率无影响。

１慢病毒载体的构建

１．１构建原理ｏｏ

慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除ｇａｇ、ｐｏｌ和ｅｎｖ这３个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括４个辅助基因，ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｐｕ和２个调节基因ｔａｔ和ｒｅｖ［３］。ＨＩＶ・ｌ是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将ＨＩＶ一１基因组中的顺式作用元件（如包装信号、长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分：包装成分由ＨＩＶ一１基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的ＨＩＶ一１顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒（ＲＣＶ）的可能性，将包装成分的５’Ｉ。ＴＲ换成巨细胞病毒（ｃＭＶ）立即早期启动子，３’Ｉ．ＴＲ换成ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达ｇａｇ和ｐｏｌ、另一个表达ｅｎｖ。根据这个原理，Ｎａｌｄｉｎｉ和Ｋａｆｒｉ等构建了三质粒表达系统“’“。１．２三质粒表达系统

三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在ＣＭＶ启动子的控制下，表达ＨＩＶ—ｌ复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白ｖｐｕ；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒Ｇ蛋白（ＶＳＶ—Ｇ），应用ＶＳＶ—Ｇ包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过

２慢病毒载体结构的优化

２．１提高载体的生物安全性

２．１．１自身失活慢病毒载体（ＳＩＮ）ＳＩＮ载体的构建是将载体３．端长末端重复序列（Ｉ．ＴＲ）中的ｕ３区增强子和启动子序列去除。Ｕ３一Ｉ。ＴＲ是前病毒ＤＮＡ两端ＬＴＲ中Ｕ３的模板，在逆转录过程中，３’ＬＴＲ中的缺失被传递到子代载体的５’Ｉ。ＴＲ中，所形成的载体缺乏ＨＩＶ一１的增强子和启动子序列，即使在所有病毒蛋白都存在的情况下也不能转录ＲＮＡ，产生了一个灭活的前病毒，但其中的外源启动子仍然有活性，能进行基因转录与表达。这种方式主要用来消除病毒ＬＴＲ中的启动子／增强子序列对病毒载体中外源启动子指导转录的干扰作用以及消除可能的由３’Ｉ，ＴＲ启动子指导的下游基因组中原癌基因的激活与转录作用，一定程度上提高了载体的安全性。其缺点是所产生的重组病毒滴度低，但Ｘｕ［日应用Ｔｅｔ一反应元件（ＴＲＥ）替代载体的Ｕ３转录调控元件，使表达Ｔｅｔ调控反式激活子（ｔＴＡ）的细胞可以产生较高滴度的病毒载体，而不表达ｔＴＡ的细胞则产量很低，同时可以在体外对ＧＦＰ或目的基因的表达加以调控。由此所产生的慢病毒载体可以高效感染大鼠的神经细胞。

２．１．２包装系统的改造Ｚｕｆ［ｅｒｅｙ”１等将包装结构中的辅助基因ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｖｐｕ和调节基因ｔａｔ去除，结果发现其保留了转导静止期细胞及单核细胞起源的巨噬细胞的能力，而且能在体内转导神经元细胞。应用这种最小的包装结构可在提高载体安全性的同时不影响其感染非分裂期细胞的特性，分析原因可能是在产生病毒颗粒的过程中，任何可能有

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复制能力的病毒载体都缺乏这些辅助蛋白和ＨＩＶ１

病毒载体，其中ＨＩＶＩ，ＴＲ中的Ｕ３区被鼠干细胞的致病特征。

病毒（ＭＳＣＶ）的Ｕ３区替代。之后用这种杂合的载ＷＵ”１等将ｇａｇ／ｇａｇ—ｐｏｌ表达框分成两个部分，体转导人脐血ＣＤ。。＋细胞，再将其植入联台免疫缺即ｇａｇ／ｇａｇ蛋白酶框和ｐｏｌ表达框，将ＨＩＶ—ｌ的ｐｏｌ陷小鼠体内，在移植后ｌ５周时可以在小鼠的淋系、和ｖｐｒ融台使ｐｏｌ基因产物（逆转录酶和整合酶）能髓系和红系细胞中观察到高水平的标志基因ＧＦＰ通过ｖｐｒ与Ｐ６的相互作用而有效地掺台到载体颗的表达。Ｃｈｏｉ。１“等发现在内部启动于ＣＭＶ作用下．

粒中去。井进一步证实此系统完全阻止了载体将功起源于ＨＩＶｌ的载体在人ＣＤ。。＋造血细胞中转基因

能性ｇａｇ—ｐｏｌ基因组传递到靶细胞中．而ｇａｇｐｏｌ结表达比起源于鼠白血病病毒（ＭＩ，Ｖ）的ＭｓｃＶ载体构对逆转录病毒ＤＮＡ的激活和ＲＣＶ的产生是绝低ｌｏｏ～１０００倍。通过用劳斯闪瘤病毒或ＭＳＣＶ的

对需要的。因此，有可能将慢病毒载体系统分成５个Ｉ。ＴＲ来替代ＣＭＶ启动子，基因表达有中度的提组成部分。即ｇａｇ氇ｉ白酶、ｖｐｒ—ｐｏｌ、ｒｅｖ、ＶＳＶ一（；包膜高。而当用ＨＩＶ／ＭＳＣＶ杂合的Ｉ。ＴＲ代替ＨＩＶ的

蛋白和载体表达框，以期进一步减少产生ＲＣＶ的ＬＴＲ且去除ＣＭＶ启动子／增强子，观察到其不仅可能性。

仍能转导非分裂期细胞，而且可以使ＧＦＰ的表达较在ＨＩＶ一１ｇａｇ—ｐｏｌ表达质粒和ＨＩＶ—ｌ载体之间

原先提高１０ｈｌｏｏ倍。有两个同源性区域：①包装信号延伸到ｇａｇ基因２．２，２内部启动子的更换

目前常用的内部启动子

中，ＨＩＶ一１载体中包含ｇａｇ序列；②载体ＲＮＡ和为ＣＭＶ，通过研究不同启动子驱动下的转基因或ｇａｇ—ｐｏｌＲＮＡ从核转至胞浆都要依赖ｒｅｖ。载体和标志基因在不同靶细胞中的表达发现．延长因子１一ｇａｇ—ｐｏｌ表达质粒中都含有ｒｅｖ反应元件（ＲＲＥ）。ａ（ＥＦｌ一ｎ）是作用最强的内部启动子ｕ“。将磷酸甘油Ｋｏｔｓｏｐｏｕｌｏｕ［９１等通过对包装结构内ｇａｇ—ｐｏｌ密码酸激酶（ＰＧＫ）与ＣＭＶ启动子比较时。得出的结果子进行优化，减小了和转移载体的序列同源性，因此不一致。在纹状体细胞中，ＰＧＫ的效率高于

减小了载体和包装结构重组的可能性。这种优化的ＣＭＶ［Ｉ６］；而在２９３Ｔ细胞和纤维肉瘤ＨＴｌ０８０细胞

包装结构可以在不依赖ｒｅｖ的情况下允许ｇａｇ—ｐｏｌ中．ＣＭＶ驱动ＧＦＰ的表达率更高ｏ“。

基因的高效表达，这就允许从包装结构中去除ｒｅｖ２．２．３中央ＤＮＡ侧翼序列的作用在ＨＩｖ—Ｉ基因和ＲＲＥ序列，从而进一步减少载体和包装结构重组中，由中央多聚嘌呤序列（ｃＰＰＴ）和中央终止序列组的可能性。Ｐａｎｄｙａ口”采用非人类慢病毒为基础的（ＣＴＳ）顺式控制的中心链替代导致了在ＨＩＶ—ｌ线载体，去除了其中的ｒｅｖ和ＲＲＥ序列，结果引起转性ＤＮＡ分子中心一段９９个核苷酸序列的重叠，即导能力的下降，之后引入脾坏死病毒的５’Ｉ。ＴＲ到包中央ＤＮＡ侧翼序列（ｃｅｎｔｒａｌ

ＤＮＡｆｌａｐ），它可促进

装质粒中，能完全恢复载体的滴度。而ＭａｕｔｉｎｏＤＩ］等ＨＩＶ一１基因组转入被感染的细胞核内。将此序列插应用ＭＰＭＶ或ｓＲＶ一１基本运输元件（ＣＴＥ）来替入慢病毒载体可以促进对ＣＤ。．＋造血干细胞的转代ｒｅｖ／ＲＲＥ缺失的ｍＲＮＡ运输机制，同样可以保导““”］。Ｐａｒｋ…３等还发现整合了ｃＰＰＴ的载体能在留感染非分裂期细胞的特性。体外增加转导效率，在体内能增加对非细胞周期肝２．１．３非人类慢病毒载体的研制

非人类慢病毒载

细胞的转导效率。

体的发展正受到人们的重视，其中包括猴免疫缺陷２．２．４内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）的作用

ＩＲＥＳ

病毒（ＳＩＶ）、猫免疫缺陷病毒（ＦＩＶ）、牛免疫缺陷病为细小ＲＮＡ病毒５７非翻译区的引导序列，所引导毒（ＢＩＶ）、马感染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）等。这些病毒的ＲＮＡ直接进入核糖体而进行帽非依赖性翻译．对人无致病性．在人类细胞中不会复制。可以高效转文献Ｒ”报道有一定的提高目的基因表达水平的作导分裂期及静止期细胞。但是ＳＩＶ和ＦＩＶ的ＲＮＡ用。有人在内部启动子之前插入ＩＲＥＳ，或直接以可与ＨＩｖ—ｌ颗粒交叉包装产生ＲＣＶ，这就在人畜ＩＲＥＳ替代内部启动子，而前者似乎更能提高目的之间产生了新的有复制能力的病毒的可能性。而且，

基因的表达。

Ｈｏ［ｍａｎｎ口２３等研究发现在非人类慢病毒载体转导

２．２．５

ＣＤ２的位点控制区（ＬＣＲ）Ｉ。ＣＲ序列与开

人细胞的过程中，可能存在转导效率的障碍。而且人放性染色体结构域的建立有关。Ｉｎｄｒａｃｃｏｌｏ”２３等用是ＨＩＶ一１的天然宿主，在人类的临床实践中应用慢病毒载体转导Ｔ细胞时．将ＣＤ２中的ＬＣＲ插入ＨＩＶ一１要比应用动物病毒所获得的期望值要高。其中，发现完整的ＬＣＲ（约２．１ｋｂ）可以提高标志基２．２提高转基因的表达

因ＧＦＰ的表达水平，而截断的ＬＣＲ（约１．０ｋｂ）不２．２．１Ｉ。ＴＲ的改造Ｇａｏ［”３等构建了一种杂合的慢

能提高ＧＦＰ的表达水平。

垦叁匿堂坌王垡塑芏坌些！！丝笙蔓！！鲞里！望２．３目的基因表达的调控

Ｋａｆｒｉ“”等构建了一个可诱导的慢病毒载体系统．其中包含完整的四环素凋控系统。在此系统中．（；ＦＰ的表达和四环素反式激活子分别在可诱导的四环素启动子和ＣＭＶ启动子控制下，在有效应底物强力霉索存在时．体外转导２９３Ｔ细胞导致低水

平的（；ＦＰ的表达；去除强力霉素后．ＧＦＰ的表达提

高５００倍。ＧＦＰｍＲＮＡ转录在加药２４ｈ内达到最大抑制。转导大鼠脑组织之后，在终末分化神经元中可见强力霉素调控的ＧＦＰ的表达，通过撤去或加人大鼠饮水中的强力霉素，可以在体内观察到ＧＦＰ的表达或抑制。但在实验中仍可观察到不被强力霉素抑制的低水平的ＧＦＰ表达，把四环素调控启动子插

入载体的Ｕ３区．可以明显减少非控制性的ＧＦＰ的

表达．同时也降低了基因表达的最大水平。

２．４靶向性问题

基因治疗中将治疗性目的基因转入特定的靶细胞井在该细胞中得到较高的表达即为基因表达的靶向性。常通过两种途径构建靶向性载体：①将病毒颗粒与某一靶向分子或特异性抗体结合；②通过改变病毒包膜蛋白的结构．使其对细胞的亲嗜性发生变化。Ｐｅｎｇｃ：”等应用带有配体ＥＧＦ多肽的载体在ＥＧＦ受体阴性细胞中有感染性，而在富含ＥＧＦ受体的细胞中，则被灭活，称为反向靶向性。将ＥＧＦ载体注人体内后发现在脾脏有虫荧光素酶表达，而在富含ＥＧＦ受体的肝脏则低表达，预先应用可溶性的ＥＧＦ来处理动物则在肝脏有高表达。Ｙｕ［２”等采用前列腺特异性抗原启动子（ＰＳＡ）编码ＧＦＰ和白喉毒素Ａ（ＤＴＡ）．在前列腺细胞中可以特异性的表达，而且具有组织特异性的ＤＴＡ蛋白的表达可以根除培养的ＩＡ，ＮＣａＰ前列腺癌细胞。提示ＰＳＡ载体对前列腺癌的靶向性。Ｍａｚａｒａｋｉｓ口。等利用狂犬病病毒对神经系统的亲嗜性及可以进行逆向轴突转运的特性构建了用狂犬病病毒包膜糖蛋白假构型的慢病毒载体。通过直接向中枢神经系统注射和经外周途径注射，在中枢神经系统中均有标志基因的表达．而作为对照的ＶＳＶ—Ｇ假构型载体则无表达。提示

・３１３・

采用改变包膜蛋白的方法亦有可能实现载体的靶向

性。

尽管慢病毒载体的研究取得了很大的进展，但欲应用于临床尚有距离。如何通过对慢病毒载体的优化获得简便高效的病毒载体包装系统、可搁控表达外源基因的病毒载体、靶向性载体及无病毒基因的病毒载体应该是今后努力的目标。相信对慢病毒载体的优化必将能为基因治疗开辟一个新的研究方

向。

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