人胚胎干细胞的研究发展

人胚胎干细胞的研究发展

摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES 细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。

关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性 干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson 等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C) ，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC 研究热潮。

人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。

1 人胚胎干细胞的来源

胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新

和多向分化的潜能。

2 人胚胎干细胞的生物学特性

(1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞;

(2)具有种系传递功能;

(3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的 ES 细胞;

(4)易于进行基因改造操作;

(5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常;

(6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性, 具有维持端粒长度, 保持干细胞增殖能力的重要作用。

3 人胚胎干细胞的培养

(1) 常规培养液 常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM) 199、F12 等合成培养基，以DMEM 应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。

(2) 无血清培养基 血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC 未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行 ESC 的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC 增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化, 是因为血清中富含中胚层诱导因子,

如骨形态形成蛋白(BMP)等。

4 人胚胎干细胞的实验研究及临床应用

4.1 人胚胎干细胞的实验研究 人ES 细胞具有多向分化潜能, 能分化为属于内胚层、中胚层和外胚层范畴的多种类型细胞:包括神经细胞、肝细胞、造血母细胞、分泌胰岛素细胞、心肌细胞、内皮细胞等。人胚胎干细胞定向诱导是指在体外把人胚胎干细胞定向诱导成分化成熟功能细胞, 而横向分化则是把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的“干细胞”或功能细胞。不论定向诱导, 还是横向分化, 它们的共同基础都是干细胞基因表达的调控。定向诱导分化根据hESC 在离体条件下可分化出不同胚层的分化细胞这一特点, 将hESC 与不同类型的细胞共培养或加入相应的生长因子诱导干细胞定向单一类型的细胞分化。目前,hESC 体外诱导分化的模式主要有诱导分化、自发分化和基因调控分化等。大量的研究表明转化生长因子(TGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、Wnt 家族蛋白 (Wnt families)、成纤维细胞生长因子(FGF)以及全反式维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)和垂体后叶素、维生素C 、5氮胞苷等可以促进ESC 分化为心肌细胞。Laura 等将人胚胎干细胞(hESC)体外诱导分化的心肌细胞, 培养观察了达3个月, 并通过膜片钳等技术来评估其功能成熟情况, 以RT PCR 来评估编码离子通道的亚基的表达; 发现随着体外培养时间的延长,ESC 分化的心肌细胞愈接近成熟心肌细胞表型。常静等发现与胎儿心肌细胞的共同培养, 能诱导人ESCs 发生向心肌方向的分化，人ESCs 有望成为心肌干细胞移植的细胞材料。Passier 等采用无血清培

养基诱导胚胎干细胞, 发现心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍, 如果在培养体系中加入维生素C, 分化效率还可以再提高40%。Maxim 等发现HESC 与骨髓基质细胞或OP9细胞共培养可诱导hESC 向造血干细胞分化。Rambhatla 等观察到,hESC 培养过程中在二甲基亚砜和丁酸钠依次诱导下形成肝细胞。裴海云等将人胚胎干细胞在细菌培养皿中悬浮培养7d, 形成囊性拟胚体, 接种至包被有Ⅰ型胶原的组织培养皿, 以含有地塞米松、胰岛素的条件培养液进行诱导, 条件诱导液培养14 d,结果证实人胚胎干细胞经上述方法培养可向肝细胞分化。Reubinoff 等报道,hESC 培养过程中加入bFGF 、维甲酸和神经生长因子后可形成大量的神经管样结构, 并能进一步分化成神经元、星形细胞和少突胶质细胞。V ogel 将人ES 细胞培养至拟胚体(EBs)后，用神经细胞培养基(常规培养神经细胞的培养基) 培养，分离出部分分化的EBs 在含碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养基中培养，最终获得96%表达神经元标志的细胞。Kwon 等在实验中将TA T PDX1融合蛋白转入HESC, 从而激活下游靶基因的表达, 促进干细胞分泌胰岛素, 比较明确的阐明了干细胞向胰岛细胞分化的机制。Kroon 等将人胚胎干细胞源性胰腺内皮层移植进入大鼠后有效的产生葡萄糖应答内皮细胞，表明人胚胎干细胞有能力产生葡萄糖应答和胰岛素分泌细胞。Tremoleda 等比较人胚胎干细胞与成体干细胞的体内骨分化能力，结果经过成骨因素予处理的hESC 均产生成骨，未经过成骨因素予处理的hESC 产生骨与软骨; 而未经过成骨因素予处理的hMSC 则不形成骨、软骨与脂肪组织，经过成骨因素予处理的hMSC 产生骨与脂肪组

织。Christian 等则通过研究得出结论，维甲酸和骨形态发生蛋白两种信号协同，可大大提高人的ES 细胞向上皮细胞的直接分化的效率。石伦刚等成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化。分化获得的细胞增殖能力强, 表达间充质干细胞的特异性标志, 并具有多向分化潜能。到目前为止, 人类胚胎干细胞被成功诱导分化为造血干细胞、神经干细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、成骨细胞、内皮细胞及滋养细胞等多种细胞, 为hESC 分化细胞的移植研究与应用奠定了实验基础。

4.2 人胚胎干细胞的临床应用 hES 可诱导分化为多种细胞，如神经细胞、心肌细胞和肝脏细胞等, 通过移植取代体内死亡或无功能的细胞提供长期治疗，可为帕金森病、心脏病、青少年糖尿病和白血病和肝脏疾病等多种临床疾病无限量提供细胞移植供体, 从而使此类疾病在治疗上发生革命性变化〔40～44〕。Roberto 研究表明, 随着胚胎干细胞研究的发展, 将其诱导分化为成熟的多巴胺能神经元及用来激活自身体内的修复机制, 治疗帕金森病是可能的。通过hESC 建立体外分化模型, 建立各种基因改变的hESC, 可发现某些基因或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的作用, 从而研究人类发育早期事件。遗传工程技术的应用, 在体外定向改造ESC 细胞后, 可对胚胎干细胞进行基因改造，将特殊改变的基因转导至胚胎干细胞中，体外选择后将胚胎干细胞导入机体，使胚胎干细胞中的遗传信息传达给子代〔46～48〕，这可能有助于某些遗传性疾病的治疗。还可将胚胎干细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入，用于研究特

定基因对胚胎发育`药物代谢和肿瘤形成的影响, 模拟细胞、组织在体内对被试药物及毒素的反应情况, 为药物筛选和潜在的毒素筛选提供更安全、廉价的模型。尽管采用干细胞移植治疗疾病的研究取得了较大进展, 但离临床应用还存在相当的距离。

5 问题与展望

胚胎干细胞在揭示生命，药物筛选、新药开发，移植治疗及研究胚胎发育和疾病发生和遗传性疾病具有极为广阔的前景，但目前尚有许多的问题需要我们去解决，首先, 须进一步的改善人胚胎干细胞的分离、培养、建系的工作, 明确细胞分化的触发与调控机制，掌握体外控制干细胞定向分化技术，控制ES 细胞将特定细胞分化的基因和环境信号，将ES 细胞定向诱导生成一种特定的细胞及一个复杂的组织或器官，建立更多的hESC 系并对其特性进行研究，解决现有的hES 细胞仍达不到临床应用的标准、可能存在异源蛋白污染及长期体外培养的hES 细胞出现分化比例偏高和基因突变，甚至染色体也会出现非整倍体改变的危险。其次，细胞或组织移植后, 可能存在ESC 致癌或形成组织瘤问题; 胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于患者的替代性治疗，存在免疫排斥反应问题。

参考文献：

1. 华进联. 窦忠英. 李松 人胚胎干细胞研究进展 [期刊论文] -中国科学基金2000(02)

2. Evans MJ.Kanfman MH Establishment in culture of pluripotent cells

from mouse embryos 2002(5819)

3. 孟凡刚, 郭建平, 吴承远, 等. 端粒酶在大鼠胚胎神经干细胞的表达及其生物学特性〔J 〕. 中华实验外科杂志，2005;22(5):572

4．胚胎干细胞研究进展 作者:谢安, 汪泱, 期刊 江西医学检验2006年 第02期

5. Bishop AE,Buttery Lee DK Polak JM.Embryonic stem cells〔J 〕.J Pathol 2002;197:424

6. Bettiol E，Sartiani L，Chicha L,et al.Fetal bovine serum enables cardiac differentiation,of,human,embryonic,stem.cell

〔J 〕.Differentiation,2007;75(8):669

7. 安世民，曾 桥，滕祥云，等. 一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养〔J 〕. 遗传 2008;30(12):1567

8. Hong mei P ，Gui an C.Serum free medium cultivation to improve efficacy in establishment of human embryonic stem cell lines〔J 〕.Human Reproduction (Oxford，England) 〔Hum Reprod〕，2006;21(1)：217

9. 常静, 雷寒, 陈建斌等. 与胎儿心肌细胞共同培养诱导人胚胎干细胞发生心肌样分化〔J 〕. 第三军医大学学报，2007;29(15):1465

10. 裴海云, 王韫芳, 杨印祥等 人胚胎干细胞体外诱导分化为肝脏细胞〔J 〕. 科学通报，2007;52(18):2135

11. 李彬, 陈洪伟, 胡智兴等. 人胚胎干细胞定向分化为神经前体细胞〔J 〕. 动物学研究，2007;28(3)：311